Edición gen CRISPR (pronunciado / k r i s p ə r / "nítido") es una ingeniería genética técnica en biología molecular por el cual los genomas de los organismos vivos se pueden modificar. Se basa en una versión simplificada del sistema de defensa antiviral bacteriano CRISPR - Cas9 . Al administrar la nucleasa Cas9 complejada con un ARN guía sintético (ARNg) en una célula, el genoma de la célula se puede cortar en una ubicación deseada, lo que permite eliminar los genes existentes y / o agregar nuevos in vivo.(en organismos vivos). [1]
La técnica se considera de gran importancia en biotecnología y medicina, ya que permite editar los genomas in vivo con una precisión extremadamente alta, de forma económica y sencilla. Puede usarse en la creación de nuevos medicamentos, productos agrícolas y organismos genéticamente modificados , o como un medio para controlar patógenos y plagas. También tiene posibilidades en el tratamiento de enfermedades genéticas hereditarias así como enfermedades derivadas de mutaciones somáticas como el cáncer. Sin embargo, su uso en la modificación genética de la línea germinal humana es muy controvertido. El desarrollo de la técnica le valió a Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier el Premio Nobel de Química en 2020. [2] [3] El tercer grupo de investigadores que compartió el Premio Kavli por el mismo descubrimiento, [4] dirigido por Virginijus Šikšnys , no fue galardonado. el premio Nobel. [5] [6] [7]
Sinopsis
Trabajando como unas tijeras genéticas, la nucleasa Cas9 abre ambas hebras de la secuencia objetivo de ADN para introducir la modificación mediante uno de dos métodos. Las mutaciones knock-in, facilitadas a través de la reparación dirigida por homología (HDR), son la vía tradicional de los enfoques de edición genómica dirigida. [8] Esto permite la introducción de daños y reparación específicos del ADN . HDR emplea el uso de secuencias de ADN similares para impulsar la reparación de la rotura mediante la incorporación de ADN exógeno para que funcione como plantilla de reparación. [8] Este método se basa en la aparición periódica y aislada de daños en el ADN en el sitio objetivo para que comience la reparación. Las mutaciones knock-out causadas por CRISPR-Cas9 dan como resultado la reparación de la rotura bicatenaria mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ). El NHEJ a menudo puede resultar en deleciones o inserciones aleatorias en el sitio de reparación, lo que puede alterar o alterar la funcionalidad del gen. Por lo tanto, la ingeniería genómica de CRISPR-Cas9 brinda a los investigadores la capacidad de generar una alteración genética aleatoria dirigida. Debido a esto, la precisión de la edición del genoma es una gran preocupación. La edición genómica conduce a cambios irreversibles en el genoma.
Si bien la edición del genoma en células eucariotas ha sido posible utilizando varios métodos desde la década de 1980, los métodos empleados han demostrado ser ineficaces y poco prácticos de implementar a gran escala. Con el descubrimiento de CRISPR y específicamente la molécula de nucleasa Cas9, la edición eficiente y altamente selectiva es ahora una realidad. Cas9 derivado de la especie bacteriana Streptococcus pyogenes ha facilitado la modificación genómica dirigida en células eucariotas al permitir un método confiable para crear una ruptura dirigida en una ubicación específica designada por las cadenas guía de crRNA y tracrRNA. [9] La facilidad con la que los investigadores pueden insertar Cas9 y ARN molde para silenciar o causar mutaciones puntuales en loci específicos ha demostrado ser invaluable para el mapeo rápido y eficiente de modelos genómicos y procesos biológicos asociados con varios genes en una variedad de eucariotas. Se han desarrollado variantes de nueva ingeniería de la nucleasa Cas9 que reducen significativamente la actividad fuera del objetivo. [10]
Las técnicas de edición del genoma CRISPR-Cas9 tienen muchas aplicaciones potenciales, incluso en medicina y agricultura. El uso del complejo CRISPR-Cas9-gRNA para la edición del genoma [11] fue la elección de la AAAS para el Avance del año en 2015. [12] Se han planteado muchas preocupaciones bioéticas sobre la posibilidad de utilizar CRISPR para la edición de la línea germinal , especialmente en embriones humanos. [13]
Historia
Otros metodos
A principios de la década de 2000, los investigadores alemanes comenzaron a desarrollar nucleasas de dedos de zinc (ZFN), proteínas sintéticas cuyos dominios de unión al ADN les permiten crear roturas de doble hebra en el ADN en puntos específicos. Los ZFN tienen una mayor precisión y la ventaja de ser más pequeños que Cas9, pero los ZFN no se utilizan con tanta frecuencia como los métodos basados en CRISPR. Sangamo proporciona ZFN a través de asociaciones académicas y de la industria, pero posee los módulos, la experiencia y las patentes para fabricarlos. En 2010, las nucleasas sintéticas llamadas nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN) proporcionaron una forma más fácil de apuntar a una ruptura de doble hebra en una ubicación específica en la hebra de ADN. Tanto las nucleasas de dedos de zinc como las TALEN requieren el diseño y la creación de una proteína personalizada para cada secuencia de ADN objetivo, lo cual es un proceso mucho más difícil y lento que el de diseñar ARN guía. Los CRISPR son mucho más fáciles de diseñar porque el proceso requiere sintetizar solo una secuencia corta de ARN, un procedimiento que ya se usa ampliamente para muchas otras técnicas de biología molecular (por ejemplo, creación de cebadores de oligonucleótidos ). [14]
Mientras que los métodos como la interferencia de ARN (ARNi) no suprimen completamente la función del gen, CRISPR, ZFN y TALEN proporcionan un bloqueo genético irreversible completo . [15] CRISPR también puede apuntar a varios sitios de ADN simultáneamente simplemente mediante la introducción de diferentes gRNA. Además, los costos de emplear CRISPR son relativamente bajos. [15] [16] [17]
Descubrimiento
En 2012, Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier publicaron su hallazgo de que CRISPR- Cas9 podría programarse con ARN para editar ADN genómico, ahora considerado uno de los descubrimientos más importantes en la historia de la biología . [18]
Patentes y comercialización
A noviembre de 2013[actualizar], SAGE Labs (parte del grupo Horizon Discovery ) tenía derechos exclusivos de una de esas empresas para producir y vender ratas modificadas genéticamente y derechos no exclusivos para modelos de ratones y conejos. [19] Para 2015[actualizar], Thermo Fisher Scientific obtuvo la licencia de propiedad intelectual de ToolGen para desarrollar kits de reactivos CRISPR. [20]
A diciembre de 2014[actualizar], se impugnaron los derechos de patente de CRISPR. Se formaron varias empresas para desarrollar fármacos relacionados y herramientas de investigación. [21] A medida que las empresas aumentaron la financiación, surgieron dudas sobre si CRISPR podría monetizarse rápidamente. [22] En febrero de 2017, la Oficina de Patentes de EE. UU. Se pronunció sobre un caso de interferencia de patentes presentado por la Universidad de California con respecto a las patentes emitidas al Broad Institute , y encontró que las patentes Broad, con reclamos que cubren la aplicación de CRISPR-Cas9 en células eucariotas , eran distintos de los inventos reivindicados por la Universidad de California. [23] [24] [25] Poco después, la Universidad de California presentó una apelación de esta decisión. [26] [27]
Eventos recientes
En marzo de 2017, la Oficina Europea de Patentes (EPO) anunció su intención de permitir solicitudes de edición de todo tipo de celdas al Instituto Max-Planck de Berlín, la Universidad de California y la Universidad de Viena, [28] [29] y en agosto de 2017 , la EPO anunció su intención de permitir reclamos CRISPR en una solicitud de patente que MilliporeSigma había presentado. [28] A agosto de 2017[actualizar]La situación de las patentes en Europa era compleja, con MilliporeSigma, ToolGen, la Universidad de Vilnius y Harvard compitiendo por reclamos, junto con la Universidad de California y Broad. [30]
En julio de 2018, el TJCE dictaminó que la edición de genes para plantas era una subcategoría de alimentos transgénicos y, por lo tanto, la técnica CRISPR estaría regulada en lo sucesivo en la Unión Europea por sus reglas y regulaciones para los transgénicos . [31]
En febrero de 2020, un ensayo en EE. UU. Mostró de forma segura la edición del gen CRISPR en tres pacientes con cáncer. [32]
En octubre de 2020, las investigadoras Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna recibieron el Premio Nobel de Química por su trabajo en este campo. [33] [34] Hicieron historia como las dos primeras mujeres en compartir este premio sin un colaborador masculino. [35]
Ingeniería del genoma
La edición del genoma CRISPR-Cas9 se lleva a cabo con un sistema CRISPR Tipo II . Cuando se utiliza para la edición del genoma, este sistema incluye Cas9 , crRNA y tracrRNA junto con una sección opcional de plantilla de reparación de ADN que se utiliza en la unión de extremos no homólogos (NHEJ) o la reparación dirigida por homología (HDR).
Componentes mayores
Componente | Función |
---|---|
crRNA | Contiene el ARN guía que localiza el segmento correcto del ADN del huésped junto con una región que se une al ARN tracr (generalmente en forma de bucle de horquilla ), formando un complejo activo. |
tracrRNA | Se une al crRNA y forma un complejo activo. |
sgRNA | Los ARN de guía única son un ARN combinado que consta de un ARNtracr y al menos un ARNcr . |
Cas9 | Enzima cuya forma activa es capaz de modificar el ADN. Existen muchas variantes con diferentes funciones (es decir, corte de hebra simple, rotura de hebra doble, unión de ADN) debido a la función de reconocimiento del sitio de ADN de cada enzima. |
Plantilla de reparación | Molécula de ADN utilizada como plantilla en el proceso de reparación del ADN de la célula huésped, lo que permite la inserción de una secuencia de ADN específica en el segmento del huésped roto por Cas9. |
CRISPR-Cas9 a menudo emplea un plásmido para transfectar las células diana. [36] Los componentes principales de este plásmido se muestran en la imagen y se enumeran en la tabla. El crRNA está diseñado de forma única para cada aplicación, ya que esta es la secuencia que utiliza Cas9 para identificar y unirse directamente a secuencias específicas dentro del ADN de la célula huésped. El crRNA debe unirse solo donde se desee editar. La plantilla de reparación también está diseñada de forma única para cada aplicación, ya que debe complementar hasta cierto punto las secuencias de ADN a cada lado del corte y también contener cualquier secuencia que se desee para la inserción en el genoma del huésped.
Se pueden empaquetar múltiples crRNA y tracrRNA para formar un RNA de guía única (sgRNA). [37] Este sgRNA puede incluirse junto con el gen que codifica la proteína Cas9 y convertirse en un plásmido para ser transfectado en células. Hay muchas herramientas en línea disponibles para ayudar a diseñar secuencias de sgRNA efectivas. [38] [39]
Estructura
CRISPR-Cas9 ofrece un alto grado de fidelidad y una construcción relativamente simple. Depende de dos factores para su especificidad: la secuencia diana y la secuencia del motivo adyacente protoespaciador (PAM). La secuencia objetivo tiene 20 bases de largo como parte de cada locus CRISPR en la matriz de crRNA. [36] Una matriz típica de crRNA tiene múltiples secuencias diana únicas. Las proteínas Cas9 seleccionan la ubicación correcta en el genoma del anfitrión utilizando la secuencia para unirse con pares de bases en el ADN del anfitrión. La secuencia no es parte de la proteína Cas9 y, como resultado, es personalizable y se puede sintetizar de forma independiente . [40] [41]
Cas9 reconoce la secuencia de PAM en el genoma del huésped. Cas9 no se puede modificar fácilmente para reconocer una secuencia PAM diferente. Sin embargo, esto finalmente no es demasiado limitante, ya que típicamente es una secuencia muy corta e inespecífica que ocurre con frecuencia en muchos lugares a lo largo del genoma (por ejemplo, la secuencia de SpCas9 PAM es 5'-NGG-3 'y en el genoma humano ocurre aproximadamente cada 8 a 12 pares de bases). [36]
Una vez que estas secuencias se han ensamblado en un plásmido y se han transfectado en las células, la proteína Cas9 con la ayuda del crRNA encuentra la secuencia correcta en el ADN de la célula huésped y, dependiendo de la variante Cas9, crea una ruptura monocatenaria o bicatenaria en la ubicación adecuada en el ADN. [42]
Las roturas monocatenarias debidamente espaciadas en el ADN del huésped pueden desencadenar la reparación dirigida por homología , que es menos propensa a errores que la unión de extremos no homólogos que normalmente sigue a una rotura bicatenaria. Proporcionar una plantilla de reparación de ADN permite la inserción de una secuencia de ADN específica en una ubicación exacta dentro del genoma. La plantilla de reparación debe extenderse de 40 a 90 pares de bases más allá de la rotura del ADN inducida por Cas9. [36] El objetivo es que el proceso HDR nativo de la célula utilice la plantilla de reparación proporcionada y, por lo tanto, incorpore la nueva secuencia en el genoma. Una vez incorporada, esta nueva secuencia ahora es parte del material genético de la célula y pasa a sus células hijas.
Entrega
La entrega de Cas9, sgRNA y complejos asociados a las células puede ocurrir a través de sistemas virales y no virales. La electroporación de ADN, ARN o ribonucleocomplejos es una técnica común, aunque puede provocar efectos nocivos en las células diana. [43] También se han utilizado técnicas de transfección química que utilizan lípidos y péptidos para introducir sgRNA en complejo con Cas9 en las células. [44] [45] Los tipos de células que son más difíciles de transfectar (por ejemplo, células, neuronas y células madre hematopoyéticas) requieren sistemas de entrega más eficientes, tales como los basados en lentivirus (LV), adenovirus (ADV), y adeno- virus asociado (AAV). [46] [47] [48]
Edición controlada del genoma
Varias variantes de CRISPR-Cas9 permiten la activación de genes o la edición del genoma con un disparador externo, como moléculas ligeras o pequeñas. [49] [50] [51] Estos incluyen sistemas CRISPR fotoactivables desarrollados fusionando proteínas asociadas a la luz con un dominio activador y un dCas9 para la activación de genes, [52] [53] o fusionando dominios similares que responden a la luz con dos construcciones de Cas9 dividido, [54] [55] o incorporando aminoácidos no naturales enjaulados en Cas9, [56] o modificando los ARN guía con complementos fotoescindibles para la edición del genoma. [57]
Los métodos para controlar la edición del genoma con moléculas pequeñas incluyen un Cas9 alostérico, sin edición de fondo detectable, que activará la unión y la escisión tras la adición de 4-hidroxitamoxifeno (4-HT), [49] Cas9 ligado a inteína que responde a 4-HT , [58] o un Cas9 que responde a 4-HT cuando se fusiona con cuatro dominios ERT2. [59] El split-Cas9 inducible por inteína permite la dimerización de fragmentos Cas9 [60] y el sistema split-Cas9 inducible por rapamicina desarrollado mediante la fusión de dos construcciones de split-Cas9 con fragmentos de FRB y FKBP . [61] Otros estudios han podido inducir la transcripción de Cas9 con una molécula pequeña, la doxiciclina . [62] [63] También se pueden usar moléculas pequeñas para mejorar la reparación dirigida por homología, [64] a menudo mediante la inhibición de la vía de unión de extremos no homólogos. [65] Estos sistemas permiten el control condicional de la actividad CRISPR para mejorar la precisión, la eficiencia y el control espacio-temporal.
Cribado CRISPR
El sistema de repeticiones de palíndromo corto agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) / Cas9 es una tecnología de edición de genes que puede inducir roturas de doble hebra (DSB) en cualquier lugar donde los ácidos ribonucleicos guía ( gRNA ) puedan unirse con la secuencia del motivo adyacente del protoespaciador (PAM). [66] Las mellas de una sola hebra también pueden ser inducidas por mutantes en el sitio activo de Cas9, [67] también conocidas como ninasas de Cas9. [68] Simplemente cambiando la secuencia de ARNg, la endonucleasa Cas9 se puede administrar a un gen de interés e inducir DSB. [69] La eficacia de la endonucleasa Cas9 y la facilidad con la que los genes pueden dirigirse al objetivo condujeron al desarrollo de bibliotecas de desactivación de CRISPR (KO) tanto para células humanas como de ratón, que pueden cubrir conjuntos de genes específicos de interés o la totalidad de genoma. [70] [71] El cribado CRISPR ayuda a los científicos a crear una perturbación genética sistemática y de alto rendimiento dentro de los organismos modelo vivos. Esta perturbación genética es necesaria para comprender completamente la función de los genes y la regulación epigenética. [72] La ventaja de las bibliotecas CRISPR agrupadas es que se pueden dirigir más genes a la vez.
Las bibliotecas knock-out se crean para lograr una representación y un rendimiento iguales en todos los ARNg expresados y portan un marcador de selección fluorescente o antibiótico que se puede usar para recuperar células transducidas. [73] Hay dos sistemas de plásmidos en las bibliotecas CRISPR / Cas9. Primero, está todo en un plásmido, donde sgRNA y Cas9 se producen simultáneamente en una célula transfectada. En segundo lugar, es un sistema de dos vectores: los plásmidos sgRNA y Cas9 se administran por separado. [72] Es importante entregar miles de vectores únicos que contienen sgRNA a un solo recipiente de células mediante la transducción viral a una baja multiplicidad de infección (MOI, típicamente de 0,1 a 0,6), ya que evita la probabilidad de que un clon de célula individual obtenga más de un tipo de sgRNA, de lo contrario, puede conducir a una asignación incorrecta de genotipo a fenotipo . [70]
Una vez preparada la biblioteca combinada, es necesario llevar a cabo una secuenciación profunda (NGS, secuenciación de próxima generación) del ADN plasmídico amplificado por PCR para revelar la abundancia de sgRNA. En consecuencia, las células de interés pueden infectarse mediante la biblioteca y luego seleccionarse de acuerdo con el fenotipo. Hay 2 tipos de selección: negativa y positiva. Mediante selección negativa, se detectan eficazmente células muertas o de crecimiento lento. Puede identificar genes esenciales para la supervivencia, que también pueden servir como candidatos para fármacos dirigidos molecularmente. Por otro lado, la selección positiva proporciona una colección de poblaciones adquiridas con ventaja de crecimiento mediante mutagénesis aleatoria. [73] Después de la selección, NGS recolecta y secuencia el ADN genómico. El agotamiento o enriquecimiento de sgRNA se detecta y se compara con la biblioteca de sgRNA original, anotado con el gen diana al que corresponde sgRNA. Luego, el análisis estadístico identifica genes que tienen una probabilidad significativa de ser relevantes para el fenotipo de interés. [70]
Biblioteca | IDENTIFICACIÓN | Especies | Pi | Genes dirigidos | ARNg por gen | GRNA totales |
---|---|---|---|---|---|---|
Biblioteca Knockout CRISPR de Bassik Mouse | 1000000121 - 1000000130 | Ratón | Bassik | Varía (∼23.000 en total) | ∼10 | Varía |
Biblioteca Knockout CRISPR del gen supresor de tumores de ratón | 113584 Red troncal EFS 113585 Red troncal TBG | Ratón | Chen | 56 | ∼4 | 286 |
Biblioteca de todo el genoma del ratón Brie | 73632 (1 plásmido) 73633 (2 plásmidos) | Ratón | Doench y Root | 19,674 | 4 | 78.637 |
Biblioteca Bassik Human CRISPR Knockout | 101926-101934 | Humano | Bassik | Varía (∼20,500 en total) | ∼10 | Varía |
Biblioteca de todo el genoma humano de Brunello | 73179 (1 plásmido) 73178 (2 plásmidos) | Humano | Doench y Root | 19,114 | 4 | 76,441 |
Biblioteca de Knockout de todo el genoma humano basada en AsCpf1 mini-humana | 130630 | Humano | Draetta | 16,977 | 3-4 | 17.032 matrices |
Además del knock-out, también hay bibliotecas de knock-down (CRISPRi) y activación (CRISPRa), que utilizan la capacidad de las proteínas de fusión Cas9 desactivadas proteolíticamente (dCas9) para unirse al ADN diana, lo que significa que el gen de interés no se corta sino está sobreexpresado o reprimido. Hizo que el sistema CRISPR / Cas9 fuera aún más interesante en la edición de genes. La proteína dCas9 inactiva modula la expresión génica dirigiéndose a los represores o activadores de dCas9 hacia los sitios de inicio de la transcripción o del promotor de los genes diana. Para reprimir genes, Cas9 se puede fusionar con el dominio efector KRAB que forma un complejo con gRNA, mientras que CRISPRa utiliza dCas9 fusionado con diferentes dominios de activación transcripcional, que son dirigidos además por gRNA a regiones promotoras para regular al alza la expresión. [75] [76] [77]
Aplicaciones
Modelos de enfermedad
La modificación genómica de Cas9 ha permitido la generación rápida y eficiente de modelos transgénicos dentro del campo de la genética. Cas9 se puede introducir fácilmente en las células diana junto con el sgRNA a través de la transfección de plásmidos para modelar la propagación de enfermedades y la respuesta de la célula y la defensa contra la infección. [78] La capacidad de Cas9 para introducirse in vivo permite la creación de modelos más precisos de la función genética y los efectos de las mutaciones, al mismo tiempo que se evitan las mutaciones fuera del objetivo que se observan típicamente con métodos más antiguos de ingeniería genética.
La revolución de CRISPR y Cas9 en el modelado genómico no se extiende solo a los mamíferos. Los modelos genómicos tradicionales como Drosophila melanogaster , uno de los primeros organismos modelo, han visto un mayor refinamiento en su resolución con el uso de Cas9. [78] Cas9 utiliza promotores específicos de células que permiten un uso controlado de Cas9. Cas9 es un método preciso para el tratamiento de enfermedades debido a que el objetivo de la enzima Cas9 solo afecta a ciertos tipos de células. Las células que se someten a la terapia Cas9 también se pueden eliminar y reintroducir para proporcionar efectos amplificados de la terapia. [79]
CRISPR-Cas9 se puede utilizar para editar el ADN de organismos in vivo y para eliminar genes individuales o incluso cromosomas completos de un organismo en cualquier momento de su desarrollo. Los cromosomas que se han eliminado con éxito in vivo utilizando técnicas CRISPR incluyen el cromosoma Y y el cromosoma X de ratones de laboratorio adultos y los cromosomas humanos 14 y 21, en líneas de células madre embrionarias y ratones aneuploides , respectivamente. Este método podría ser útil para tratar trastornos genéticos causados por un número anormal de cromosomas, como el síndrome de Down y los trastornos intersexuales . [80]
La edición del genoma in vivo con éxito mediante CRISPR-Cas9 se ha demostrado en numerosos organismos modelo, incluidos Escherichia coli , [81] Saccharomyces cerevisiae , [82] Candida albicans , [83] Caenorhabditis elegans , [84] Arabidopsis spp., [85] Danio rerio , [86] y Mus musculus . [87] [88] Se han logrado éxitos en el estudio de la biología básica, en la creación de modelos de enfermedades, [84] [89] y en el tratamiento experimental de modelos de enfermedades. [90]
Se ha planteado la preocupación de que los efectos fuera del objetivo (edición de genes además de los previstos) pueden confundir los resultados de un experimento de edición de genes CRISPR (es decir, el cambio fenotípico observado puede no deberse a la modificación del gen objetivo, sino a algún otro gen). Se han realizado modificaciones a CRISPR para minimizar la posibilidad de efectos fuera del objetivo. Los experimentos CRISPR ortogonales a menudo se recomiendan para confirmar los resultados de un experimento de edición de genes. [91] [92]
CRISPR simplifica la creación de organismos genéticamente modificados para la investigación que imitan una enfermedad o muestran lo que sucede cuando un gen es derribado o mutado. CRISPR puede usarse a nivel de línea germinal para crear organismos en los que el gen objetivo cambia en todas partes (es decir, en todas las células / tejidos / órganos de un organismo multicelular), o puede usarse en células que no son de línea germinal para crear cambios locales que solo afectan a determinadas poblaciones de células dentro del organismo. [93] [94] [95]
CRISPR se puede utilizar para crear modelos celulares humanos de enfermedad. [96] Por ejemplo, cuando se aplica a células madre pluripotentes humanas , CRISPR se ha utilizado para introducir mutaciones dirigidas en genes relevantes para la enfermedad renal poliquística (PKD) y la glomeruloesclerosis focal y segmentaria (FSGS). [97] Estas células madre pluripotentes modificadas con CRISPR se cultivaron posteriormente en organoides de riñón humano que presentaban fenotipos específicos de la enfermedad. Los organoides renales de células madre con mutaciones de PKD formaron estructuras quísticas grandes y translúcidas a partir de los túbulos renales. Los quistes eran capaces de alcanzar dimensiones macroscópicas, hasta un centímetro de diámetro. [98] Los organoides renales con mutaciones en un gen vinculado a la GEFS desarrollaron defectos de unión entre los podocitos , las células filtrantes afectadas en esa enfermedad. Esto se atribuyó a la incapacidad de los podocitos para formar microvellosidades entre las células adyacentes. [99] Es importante destacar que estos fenotipos de enfermedades estaban ausentes en los organoides de control con antecedentes genéticos idénticos, pero carecían de las modificaciones CRISPR. [97]
Se adoptó un enfoque similar para modelar el síndrome de QT largo en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes. [100] Estos modelos celulares generados por CRISPR, con controles isogénicos, proporcionan una nueva forma de estudiar enfermedades humanas y probar fármacos.
Biomedicina
La tecnología CRISPR-Cas se ha propuesto como tratamiento para múltiples enfermedades humanas, especialmente aquellas de causa genética. [101] Su capacidad para modificar secuencias de ADN específicas lo convierte en una herramienta con potencial para corregir mutaciones que causan enfermedades. Las primeras investigaciones en modelos animales sugieren que las terapias basadas en la tecnología CRISPR tienen potencial para tratar una amplia gama de enfermedades, [102] incluido el cáncer, [103] progeria , [104] beta-talasemia, [105] [106] enfermedad de células falciformes , [107] hemofilia , [108] fibrosis quística , [109] distrofia muscular de Duchenne , [110] enfermedad de Huntington , [111] [112] y enfermedad cardíaca. [113] CRISPR también se ha utilizado para curar la malaria en mosquitos, lo que podría eliminar el vector y la enfermedad en humanos. [114] CRISPR también puede tener aplicaciones en ingeniería de tejidos y medicina regenerativa, como la creación de vasos sanguíneos humanos que carecen de expresión de proteínas MHC de clase II , que a menudo causan rechazo de trasplantes. [115]
Además, los ensayos clínicos para curar la beta talasemia y la anemia de células falciformes en pacientes humanos que utilizan la tecnología CRISPR-Cas9 han mostrado resultados prometedores. [116] [117]
CRISPR en el tratamiento de infecciones
Las "nucleasas guiadas por ARN" basadas en CRISPR-Cas pueden usarse para apuntar a factores de virulencia , genes que codifican resistencia a antibióticos y otras secuencias de interés médicamente relevantes. Por tanto, esta tecnología representa una forma novedosa de terapia antimicrobiana y una estrategia para manipular poblaciones bacterianas. [118] [119] Estudios recientes sugieren una correlación entre la interferencia del locus CRISPR-Cas y la adquisición de resistencia a los antibióticos. [120] Este sistema proporciona protección a las bacterias contra la invasión de ADN extraño, como transposones , bacteriófagos y plásmidos. Se demostró que este sistema ejerce una fuerte presión selectiva para la adquisición de resistencia a los antibióticos y factor de virulencia en patógenos bacterianos. [120]
Las terapias basadas en la tecnología de edición de genes CRISPR-Cas3 suministrada por bacteriófagos diseñados podrían usarse para destruir el ADN objetivo en patógenos. [121] Cas3 es más destructivo que el más conocido Cas9. [122] [123]
La investigación sugiere que CRISPR es una forma eficaz de limitar la replicación de múltiples herpesvirus . Fue capaz de erradicar el ADN viral en el caso del virus de Epstein-Barr (EBV). Los CRISPR anti-herpesvirus tienen aplicaciones prometedoras, como eliminar el VEB que causa cáncer de las células tumorales, ayudar a eliminar los órganos donados para pacientes inmunodeprimidos de invasores virales o prevenir brotes de herpes labial e infecciones oculares recurrentes al bloquear la reactivación del VHS-1 . A agosto de 2016[actualizar], estos estaban esperando pruebas. [124]
CRISPR puede revivir el concepto de trasplante de órganos de animales a personas. Los retrovirus presentes en los genomas animales podrían dañar a los receptores de trasplantes. En 2015, un equipo eliminó 62 copias de una secuencia de ADN retroviral particular del genoma del cerdo en una célula epitelial del riñón. [125] Los investigadores demostraron recientemente la capacidad de dar a luz muestras de cerdos vivos después de eliminar estos retrovirus de su genoma utilizando CRISPR por primera vez. [126]
CRISPR y cáncer
CRISPR también ha encontrado muchas aplicaciones en el desarrollo de inmunoterapias basadas en células. [127] El primer ensayo clínico que involucró a CRISPR comenzó en 2016. Implicó eliminar células inmunes de personas con cáncer de pulmón, usar CRISPR para editar el gen PD-1 expresado y luego administrar las células alteradas a la misma persona. Otros 20 ensayos estaban en marcha o casi listos, principalmente en China, en 2017[actualizar]. [103]
En 2016, la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) aprobó un ensayo clínico en el que CRISPR se usaría para alterar las células T extraídas de personas con diferentes tipos de cáncer y luego administrar esas células T modificadas genéticamente a las mismas personas. [128]
En noviembre de 2020, CRISPR se ha utilizado de forma eficaz para tratar el glioblastoma (tumor cerebral de rápido crecimiento) y el cáncer de ovario metastásico , ya que se trata de dos cánceres con algunos de los peores mejores pronósticos y, por lo general, se diagnostican durante sus últimas etapas. Los tratamientos dieron como resultado la inhibición del crecimiento tumoral y un aumento de la supervivencia en un 80% para el cáncer de ovario metastásico y la apoptosis de las células tumorales , inhibieron el crecimiento del tumor en un 50% y mejoraron la supervivencia en un 30% para el glioblastoma. [129]
Derribo / activación
El uso de versiones "muertas" de Cas9 ( dCas9 ) elimina la capacidad de corte de ADN de CRISPR, al tiempo que conserva su capacidad para apuntar a secuencias deseables. Múltiples grupos agregaron varios factores reguladores a dCas9s, lo que les permitió activar o desactivar casi cualquier gen o ajustar su nivel de actividad. [125] Al igual que el ARNi, la interferencia CRISPR (CRISPRi) apaga los genes de manera reversible al apuntar, pero no cortar un sitio. El sitio objetivo está metilado, modificando epigenéticamente el gen. Esta modificación inhibe la transcripción. Estas modificaciones colocadas con precisión pueden usarse para regular los efectos sobre las expresiones génicas y la dinámica del ADN después de la inhibición de ciertas secuencias del genoma dentro del ADN. En los últimos años, se han investigado de cerca las marcas epigenéticas en diferentes células humanas y se ha encontrado que ciertos patrones dentro de las marcas se correlacionan con todo, desde el crecimiento de tumores hasta la actividad cerebral. [11] Por el contrario, la activación mediada por CRISPR (CRISPRa) promueve la transcripción de genes. [130] Cas9 es una forma eficaz de apuntar y silenciar genes específicos a nivel del ADN. [131] En las bacterias, la presencia de Cas9 solo es suficiente para bloquear la transcripción. Para aplicaciones en mamíferos, se agrega una sección de proteína. Su ARN guía se dirige a secuencias de ADN reguladoras llamadas promotores que preceden inmediatamente al gen diana. [132]
Cas9 se utilizó para transportar factores de transcripción sintéticos que activaban genes humanos específicos. La técnica logró un fuerte efecto al apuntar múltiples construcciones CRISPR a ubicaciones ligeramente diferentes en el promotor del gen. [132]
Edición de ARN
En 2016, los investigadores demostraron que CRISPR de una bacteria bucal común podría usarse para editar ARN . Los investigadores buscaron en las bases de datos que contienen cientos de millones de secuencias genéticas aquellas que se parecían a los genes CRISPR. Consideraron la fusobacteria Leptotrichia shahii . Tenía un grupo de genes que se parecían a los genes CRISPR, pero con diferencias importantes. Cuando los investigadores equiparon a otras bacterias con estos genes, a los que llamaron C2c2, descubrieron que los organismos obtuvieron una nueva defensa. [133] Posteriormente , C2c2 pasó a llamarse Cas13a para ajustarse a la nomenclatura estándar de los genes Cas. [134]
Muchos virus codifican su información genética en ARN en lugar de ADN que reutilizan para producir nuevos virus. El VIH y el poliovirus son esos virus. Las bacterias con Cas13 producen moléculas que pueden desmembrar el ARN y destruir el virus. Adaptar estos genes abrió cualquier molécula de ARN a la edición. [133]
Sistemas de CRISPR-cas se pueden emplear también para la edición de micro-ARN y largo no codificantes de ARN genes en las plantas. [135]
Impulsión genética
Los impulsores genéticos pueden proporcionar una herramienta poderosa para restablecer el equilibrio de los ecosistemas al eliminar las especies invasoras. Se han planteado inquietudes con respecto a la eficacia, las consecuencias no deseadas en las especies objetivo y las especies no objetivo, especialmente en relación con la posibilidad de una liberación accidental de los laboratorios a la naturaleza. Los científicos han propuesto varias salvaguardias para garantizar la contención de impulsos genéticos experimentales, incluidos los moleculares, reproductivos y ecológicos. [136] Muchos recomiendan que los impulsos de inmunización y reversión se desarrollen junto con los impulsos genéticos para sobreescribir sus efectos si es necesario. [137] Sigue existiendo consenso en que los efectos a largo plazo deben estudiarse más a fondo, particularmente en el potencial de alteración ecológica que no se puede corregir con impulsos de inversión. [138] Como tal, se requeriría la computación del ADN .
Agotamiento genético in vitro
Las bibliotecas de secuenciación no enriquecidas a menudo tienen abundantes secuencias no deseadas. Cas9 puede agotar específicamente las secuencias no deseadas con rotura de doble cadena con una eficiencia de hasta el 99% y sin efectos significativos fuera del objetivo como se ve con las enzimas de restricción . El tratamiento con Cas9 puede agotar abundante ARNr al tiempo que aumenta la sensibilidad a los patógenos en las bibliotecas de ARN-seq. [139]
Edición principal
La edición principal [140] (o edición básica) es un refinamiento de CRISPR para insertar o eliminar con precisión secciones de ADN. Las ediciones de CRISPR no siempre son perfectas y los cortes pueden terminar en el lugar equivocado. Ambos temas son un problema para el uso de la tecnología en medicina. [141] La edición principal no corta el ADN de doble hebra, sino que utiliza el aparato de direccionamiento CRISPR para transportar una enzima adicional a una secuencia deseada, donde convierte un solo nucleótido en otro. [142] La nueva guía, llamada pegRNA, contiene una plantilla de RNA para que se agregue una nueva secuencia de ADN al genoma en la ubicación objetivo. Eso requiere una segunda proteína, unida a Cas9: una enzima transcriptasa inversa, que puede producir una nueva hebra de ADN a partir de la plantilla de ARN e insertarla en el sitio de la muesca. [143] Esos tres eventos de emparejamiento independientes brindan cada uno una oportunidad para evitar secuencias fuera del objetivo, lo que aumenta significativamente la flexibilidad de orientación y la precisión de edición. [142] La edición principal fue desarrollada por investigadores del Instituto Broad del MIT y Harvard en Massachusetts. [144] Se necesita más trabajo para optimizar los métodos. [144] [143]
sociedad y Cultura
Modificación de la línea germinal humana
En marzo de 2015, varios grupos habían anunciado una investigación en curso con la intención de sentar las bases para aplicar CRISPR a embriones humanos para la ingeniería de la línea germinal humana , incluidos laboratorios en los EE. UU., China y el Reino Unido, así como la empresa de biotecnología estadounidense OvaScience . [145] Los científicos, incluido un co-descubridor de CRISPR, instaron a una moratoria mundial sobre la aplicación de CRISPR a la línea germinal humana, especialmente para uso clínico. Dijeron que "los científicos deberían evitar incluso intentar, en jurisdicciones laxas, la modificación del genoma de la línea germinal para la aplicación clínica en humanos" hasta que las implicaciones completas "se discutan entre las organizaciones científicas y gubernamentales". [146] [147] Estos científicos apoyan más investigaciones de bajo nivel sobre CRISPR y no ven a CRISPR lo suficientemente desarrollado para ningún uso clínico en la realización de cambios hereditarios en humanos. [148]
En abril de 2015, científicos chinos informaron los resultados de un intento de alterar el ADN de embriones humanos no viables utilizando CRISPR para corregir una mutación que causa la beta talasemia , un trastorno hereditario letal. [149] [150] El estudio había sido previamente rechazado por Nature y Science en parte debido a preocupaciones éticas. [151] Los experimentos dieron como resultado el cambio exitoso de solo algunos de los genes previstos y tuvieron efectos fuera del objetivo en otros genes. Los investigadores afirmaron que CRISPR no está listo para su aplicación clínica en medicina reproductiva . [151] En abril de 2016, se informó que científicos chinos hicieron un segundo intento fallido de alterar el ADN de embriones humanos no viables usando CRISPR, esta vez para alterar el gen CCR5 para hacer que el embrión sea resistente a la infección por VIH . [152]
En diciembre de 2015, se llevó a cabo en Washington una Cumbre Internacional sobre Edición Genética Humana bajo la dirección de David Baltimore . Los miembros de las academias científicas nacionales de EE. UU., Reino Unido y China discutieron la ética de la modificación de la línea germinal. Acordaron apoyar la investigación básica y clínica bajo ciertas pautas legales y éticas. Se hizo una distinción específica entre las células somáticas , donde los efectos de las ediciones se limitan a un solo individuo, y las células de la línea germinal, donde los cambios del genoma pueden ser heredados por los descendientes. Las modificaciones heredables podrían tener consecuencias no deseadas y de largo alcance para la evolución humana, genéticamente (por ejemplo, interacciones gen-ambiente) y culturalmente (por ejemplo, darwinismo social ). La alteración de gametocitos y embriones para generar cambios hereditarios en humanos se definió como irresponsable. El grupo acordó iniciar un foro internacional para abordar tales preocupaciones y armonizar las regulaciones entre países. [153]
En febrero de 2017, el Comité de edición de genes humanos de las Academias Nacionales de Ciencias, Ingeniería y Medicina de los Estados Unidos ( NASEM ) publicó un informe en el que se revisaban las preocupaciones éticas, legales y científicas de la tecnología de la ingeniería genómica. La conclusión del informe indicó que la edición hereditaria del genoma no es permisible ahora, pero podría estar justificada para ciertas condiciones médicas; sin embargo, no justificaron el uso de CRISPR para la mejora. [154]
En noviembre de 2018, Jiankui He anunció que había editado dos embriones humanos para intentar desactivar el gen de CCR5 , que codifica un receptor que el VIH usa para ingresar a las células. Dijo que las gemelas, Lulu y Nana , habían nacido unas semanas antes. Dijo que las niñas todavía llevaban copias funcionales de CCR5 junto con CCR5 discapacitado ( mosaicismo ) y aún eran vulnerables al VIH. El trabajo fue ampliamente condenado como poco ético, peligroso y prematuro. [155] Un grupo internacional de científicos pidió una moratoria global sobre la edición genética de embriones humanos. [156]
Barreras políticas a la ingeniería genética
Las normas de política para el sistema CRISPR-Cas9 varían en todo el mundo. En febrero de 2016, los reguladores dieron permiso a científicos británicos para modificar genéticamente embriones humanos mediante el uso de CRISPR-Cas9 y técnicas relacionadas. Sin embargo, a los investigadores se les prohibió implantar los embriones y los embriones debían ser destruidos después de siete días. [157]
Estados Unidos tiene un elaborado sistema regulatorio interdepartamental para evaluar nuevos alimentos y cultivos modificados genéticamente. Por ejemplo, la Ley de Protección de Riesgos Agrícolas de 2000 otorga al Departamento de Agricultura de los Estados Unidos la autoridad para supervisar la detección, el control, la erradicación, la supresión, la prevención o el retraso de la propagación de plagas de plantas o malezas nocivas para proteger la agricultura, el medio ambiente, y economía de los Estados Unidos. La ley regula cualquier organismo genéticamente modificado que utilice el genoma de una "plaga vegetal" predefinida o cualquier planta que no haya sido categorizada previamente. [158] En 2015, Yinong Yang desactivó con éxito 16 genes específicos en el hongo botón blanco para que no se oscurecieran. Dado que no había agregado ningún ADN de especies extrañas ( transgénicas ) a su organismo, el hongo no podía ser regulado por el USDA bajo la Sección 340.2. [159] El hongo botón blanco de Yang fue el primer organismo genéticamente modificado con el sistema de proteínas CRISPR-Cas9 en aprobar la regulación estadounidense. [160]
En 2016, el USDA patrocinó un comité para considerar la política reguladora futura para las próximas técnicas de modificación genética. Con la ayuda de las Academias Nacionales de Ciencias, Ingeniería y Medicina de EE. UU. , Los grupos de intereses especiales se reunieron el 15 de abril para contemplar los posibles avances en ingeniería genética dentro de los próximos cinco años y cualquier nueva regulación que pudiera ser necesaria como resultado. [161] En 2017, la Administración de Alimentos y Medicamentos propuso una regla que clasificaría las modificaciones de ingeniería genética a los animales como "medicamentos para animales", sometiéndolos a una regulación estricta si se ofrecen a la venta y reduciendo la capacidad de los individuos y las pequeñas empresas para hacerlos rentables. . [162] [163]
En China, donde las condiciones sociales contrastan marcadamente con las de Occidente, las enfermedades genéticas conllevan un gran estigma. [164] Esto deja a China con menos barreras políticas para el uso de esta tecnología. [165] [166]
Reconocimiento
En 2012 y 2013, CRISPR fue un segundo puesto en la revista Science 's Revelación del Año premio. En 2015, fue el ganador de ese premio. [125] CRISPR fue nombrada como una de las 10 tecnologías innovadoras de MIT Technology Review en 2014 y 2016. [167] [168] En 2016, Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier , junto con Rudolph Barrangou, Philippe Horvath y Feng Zhang ganaron el Premio Gairdner International. En 2017, Doudna y Charpentier recibieron el Premio Japón en Tokio, Japón por su revolucionaria invención de CRISPR-Cas9. En 2016, Charpentier, Doudna y Zhang ganaron el Premio Tang en Ciencias Biofarmacéuticas. [169] En 2020, Charpentier y Doudna recibieron el Premio Nobel de Química , el primer premio de este tipo para un equipo exclusivamente femenino, "por el desarrollo de un método para la edición del genoma". [170]
Ver también
- Herramientas CRISPR / Cas
- El diario CRISPR
- Eugenesia
- DRACO
- Dedo de zinc
- Nocaut genético
- Genética
- Glosario de genética
- Human Nature (documental de 2019)
- Edición de genes LEAPER
- ARNi
- ARNip
- Ensayo de nucleasa de topógrafo
- Biología sintética
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