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Inmunohistoquímica cromogénica de un riñón normal dirigido a la proteína CD10 .
Inmunofluorescencia de piel humana utilizando un anticuerpo anti-IgA. La piel es de un paciente con púrpura de Henoch-Schönlein : se encuentran depósitos de IgA en las paredes de pequeños capilares superficiales (flechas amarillas). El área verde ondulada pálida en la parte superior es la epidermis , el área fibrosa inferior es la dermis .

La inmunohistoquímica ( IHC ) es la aplicación más común de inmunotinción . Implica el proceso de identificación selectiva de antígenos (proteínas) en células de una sección de tejido mediante la explotación del principio de que los anticuerpos se unen específicamente a antígenos en tejidos biológicos . [1] IHC toma su nombre de las raíces "inmuno", en referencia a los anticuerpos utilizados en el procedimiento, e "histo", que significa tejido (comparar con inmunocitoquímica ). Albert Coons conceptualizó e implementó por primera vez el procedimiento en 1941. [2]

La visualización de una interacción anticuerpo-antígeno se puede lograr de varias formas, principalmente de las siguientes:

La tinción inmunohistoquímica se usa ampliamente en el diagnóstico de células anormales como las que se encuentran en los tumores cancerosos . Los marcadores moleculares específicos son característicos de eventos celulares particulares como la proliferación o muerte celular ( apoptosis ). [4] La inmunohistoquímica también se usa ampliamente en la investigación básica para comprender la distribución y localización de biomarcadores y proteínas expresadas diferencialmente en diferentes partes de un tejido biológico.

Preparación de la muestra [ editar ]

La preparación de la muestra es fundamental para mantener la morfología celular, la arquitectura del tejido y la antigenicidad de los epítopos diana . Esto requiere una recolección, fijación y corte adecuados de tejido . A menudo se usa una solución de formalina para fijar el tejido, pero se pueden usar otros métodos.

Preparación de cortes de tejido [ editar ]

A continuación, el tejido puede cortarse en rodajas o usarse entero, dependiendo del propósito del experimento o del tejido en sí. Antes de seccionar, la muestra de tejido se puede incrustar en un medio, como cera de parafina o criomedia. Las secciones se pueden cortar en una variedad de instrumentos, más comúnmente un micrótomo , criostato o vibratomo . Las muestras se cortan típicamente en un rango de 3 µm-5 µm . [ cita requerida ] Luego, las rebanadas se montan en portaobjetos, se deshidratan con lavados con alcohol de concentraciones crecientes (por ejemplo, 50%, 75%, 90%, 95%, 100%) y se aclaran con un detergente como el xileno antes de obtener la imagen debajo de un microscopio.

Dependiendo del método de fijación y preservación del tejido, la muestra puede requerir pasos adicionales para que los epítopos estén disponibles para la unión de anticuerpos, incluida la desparafinización y la recuperación de antígenos. Para los tejidos incluidos en parafina fijados con formalina, la recuperación de antígenos a menudo es necesaria e implica el tratamiento previo de las secciones con calor o proteasa . [1] [5] Estos pasos pueden marcar la diferencia entre la tinción de los antígenos diana o la no tinción.

Reducción de la inmunotinción inespecífica [ editar ]

Dependiendo del tipo de tejido y del método de detección de antígeno, es posible que sea necesario bloquear o apagar la biotina o las enzimas endógenas , respectivamente, antes de la tinción del anticuerpo. Aunque los anticuerpos muestran avidez preferencial por epítopos específicos, pueden unirse parcial o débilmente a sitios en proteínas inespecíficas (también llamados sitios reactivos) que son similares a los sitios de unión afines en el antígeno diana. Una gran cantidad de unión no específica provoca una alta tinción de fondo que enmascara la detección del antígeno diana. Para reducir la tinción de fondo en IHC, ICC y otros métodos de inmunotinción, las muestras se incuban con un tampón que bloquea los sitios reactivos a los que de otro modo se pueden unir los anticuerpos primarios o secundarios. Bloqueo comúnlos tampones incluyen suero normal, leche en polvo desnatada, BSA o gelatina. Se encuentran disponibles tampones de bloqueo comerciales con formulaciones patentadas para mayor eficiencia. Los métodos para eliminar la tinción de fondo incluyen la dilución de los anticuerpos primarios o secundarios, cambiar el tiempo o la temperatura de incubación y usar un sistema de detección diferente o un anticuerpo primario diferente. El control de calidad debe incluir, como mínimo, un tejido que se sepa que expresa el antígeno como control positivo y controles negativos de tejido que se sepa que no expresa el antígeno, así como el tejido de prueba sondeado de la misma manera con la omisión del anticuerpo primario (o mejor , absorción del anticuerpo primario). [1]

Etiquetado de muestra [ editar ]

Tipos de anticuerpos [ editar ]

Los anticuerpos usados ​​para la detección específica pueden ser policlonales o monoclonales . Los anticuerpos policlonales se preparan inyectando a los animales la proteína de interés o un fragmento de péptido y, después de que se estimula una respuesta inmunitaria secundaria, aislando los anticuerpos del suero completo. Por tanto, los anticuerpos policlonales son una mezcla heterogénea de anticuerpos que reconocen varios epítopos . Los anticuerpos monoclonales se producen inyectando al animal y luego tomando una muestra específica de tejido inmunológico, aislando una célula madre y usando la línea inmortalizada resultante para crear anticuerpos. Esto hace que los anticuerpos muestren especificidad por un solo epítopo. [6]

Para las estrategias de detección inmunohistoquímica, los anticuerpos se clasifican como reactivos primarios o secundarios. Los anticuerpos primarios se generan contra un antígeno de interés y, por lo general, no están conjugados (sin marcar), mientras que los anticuerpos secundarios se generan contra las inmunoglobulinas de las especies de anticuerpos primarios. El anticuerpo secundario normalmente se conjuga con una molécula enlazadora, como la biotina , que luego recluta moléculas indicadoras, o el propio anticuerpo secundario se une directamente a la molécula indicadora. [3]

Reporteros de IHC [ editar ]

Las moléculas indicadoras varían según la naturaleza del método de detección, siendo las más populares la detección cromogénica y de fluorescencia mediada por una enzima o un fluoróforo, respectivamente. Con los reporteros cromogénicos, una etiqueta de enzima reacciona con un sustrato para producir un producto de color intenso que se puede analizar con un microscopio óptico ordinario. Si bien la lista de sustratos enzimáticos es extensa, la fosfatasa alcalina (AP) y la peroxidasa de rábano picante (HRP) son las dos enzimas más utilizadas como marcadores para la detección de proteínas. Se encuentra disponible una variedad de sustratos cromogénicos, fluorogénicos y quimioluminiscentes para su uso con cualquiera de las enzimas, incluidas DAB o BCIP / NBT, que producen una tinción marrón o púrpura, respectivamente, dondequiera que se unan las enzimas. La reacción con DAB se puede mejorar usando níquel , [7] produciendo una tinción de color morado oscuro / negro.

Los indicadores fluorescentes son moléculas orgánicas pequeñas que se utilizan para la detección de IHC y tradicionalmente incluyen FITC , TRITC y AMCA, mientras que los derivados comerciales, incluidos Alexa Fluors y Dylight Fluors, muestran un rendimiento mejorado similar pero varían en precio. Para los métodos de detección cromogénica y fluorescente, el análisis densitométrico de la señal puede proporcionar datos semi y totalmente cuantitativos, respectivamente, para correlacionar el nivel de la señal informadora con el nivel de expresión o localización de la proteína.

Inmunohistoquímica cromogénica: la célula está expuesta a un anticuerpo primario (rojo) que se une a un antígeno específico (cuadrado púrpura). El anticuerpo primario se une a un anticuerpo secundario (verde) que está químicamente acoplado a una enzima (azul). La enzima cambia el color del sustrato a uno más pigmentado (estrella marrón).

Métodos de detección de antígenos diana [ editar ]

El método directo es un método de tinción de un solo paso e implica un anticuerpo marcado (por ejemplo, antisuero conjugado con FITC ) que reacciona directamente con el antígeno en secciones de tejido. Si bien esta técnica utiliza solo un anticuerpo y, por lo tanto, es simple y rápida, la sensibilidad es menor debido a la poca amplificación de la señal, en contraste con los enfoques indirectos. [3] Sin embargo, esta estrategia se utiliza con menos frecuencia que su contraparte de fases múltiples.

El método indirecto involucra un anticuerpo primario no marcado (primera capa) que se une al antígeno diana en el tejido y un anticuerpo secundario marcado (segunda capa) que reacciona con el anticuerpo primario. Como se mencionó anteriormente, el anticuerpo secundario debe producirse contra la IgG de la especie animal en la que se ha producido el anticuerpo primario. Este método es más sensible que las estrategias de detección directa debido a la amplificación de la señal debido a la unión de varios anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario si el anticuerpo secundario está conjugado con el informador fluorescente o enzimático . [3]

Se puede lograr una mayor amplificación si el anticuerpo secundario se conjuga con varias moléculas de biotina , que pueden reclutar complejos de enzima unida a la proteína avidina , estreptavidina o NeutrAvidina . [3] La diferencia entre estas tres proteínas de unión a biotina es su afinidad de unión individual a los tejidos endógenos que conducen a una unión inespecífica y un fondo elevado; la clasificación de estas proteínas en función de sus afinidades de unión inespecíficas, de mayor a menor, es: 1) avidina, 2) estreptavidina y 3) proteína NeutrAvidina.

El método indirecto, además de su mayor sensibilidad, también tiene la ventaja de que sólo se necesita generar un número relativamente pequeño de anticuerpos secundarios estándar conjugados (marcados). Por ejemplo, un anticuerpo secundario marcado generado contra IgG de conejo, que se puede comprar "listo para usar", es útil con cualquier anticuerpo primario generado en conejo. Esto es posible porque todas las IgG de conejo en este ejemplo tendrían la misma región Fc (constante), por lo que incluso con un pequeño número de anticuerpos secundarios anti-conejo generados, cada uno podría adherirse a cualquier anticuerpo primario de conejo. [3]Esto es particularmente útil cuando un investigador está marcando más de un anticuerpo primario, ya sea debido a la selección policlonal que produce una serie de anticuerpos primarios para un antígeno singular o cuando hay interés en múltiples antígenos. Con el método directo, sería necesario marcar cada anticuerpo primario para cada antígeno de interés.

Contratinciones [ editar ]

Después de la tinción inmunohistoquímica del antígeno diana, a menudo se aplica una segunda tinción para proporcionar un contraste que ayude a destacar la tinción primaria. Muchas de estas tinciones muestran especificidad para clases específicas de biomoléculas, mientras que otras teñirán la célula completa. [3] Tanto los tintes cromogénicos como los fluorescentes están disponibles para IHC para proporcionar una amplia gama de reactivos que se adaptan a cada diseño experimental, e incluyen: hematoxilina , tinción de Hoechst y DAPI que se utilizan comúnmente.

Solución de problemas [ editar ]

En las técnicas inmunohistoquímicas, hay varios pasos antes de la tinción final del antígeno tisular, que pueden causar una variedad de problemas que incluyen tinción de fondo fuerte, tinción de antígeno diana débil y autofluorescencia . La biotina endógena o las enzimas informadoras o la reactividad cruzada de anticuerpos primarios / secundarios son causas comunes de tinción de fondo fuerte, mientras que la tinción débil puede ser causada por una actividad enzimática deficiente o la potencia del anticuerpo primario. Además, la autofluorescencia puede deberse a la naturaleza del tejido o al método de fijación. Estos aspectos de la preparación de tejidos por IHC y la tinción de anticuerpos deben abordarse sistemáticamente para identificar y superar los problemas de tinción. [8]

Marcadores de IHC de diagnóstico [ editar ]

La IHC es una técnica de detección excelente y tiene la gran ventaja de poder mostrar exactamente dónde se encuentra una proteína determinada dentro del tejido examinado. También es una forma eficaz de examinar los tejidos. Esto la ha convertido en una técnica ampliamente utilizada en las neurociencias , que permite a los investigadores examinar la expresión de proteínas dentro de estructuras cerebrales específicas. Su principal desventaja es que, a diferencia de las técnicas de inmunotransferencia en las que la tinción se compara con una escala de peso molecular , es imposible demostrar en IHC que la tinción se corresponde con la proteína de interés. Por esta razón, los anticuerpos primarios deben estar bien validados en un procedimiento de Western Blot o similar. La técnica se utiliza aún más ampliamente en el diagnóstico.patología quirúrgica para inmunofenotipificación de tumores (por ejemplo, inmunotinción para e-cadherina para diferenciar entre DCIS (carcinoma ductal in situ: tinción positiva) y LCIS (carcinoma lobulillar in situ: no tinción positiva) [9] ). Más recientemente, las técnicas inmunohistoquímicas han sido útiles en el diagnóstico diferencial de múltiples formas de carcinomas de glándulas salivales, cabeza y cuello. [10]

La diversidad de marcadores IHC utilizados en patología quirúrgica diagnóstica es sustancial. Muchos laboratorios clínicos en hospitales terciarios tendrán menús de más de 200 anticuerpos utilizados como biomarcadores de diagnóstico, pronóstico y predicción. Algunos ejemplos de marcadores de uso común incluyen:

  • BrdU : se utiliza para identificar células en replicación. Se utiliza para identificar tumores, así como en la investigación de neurociencias. [11]
  • Citoqueratinas : se utilizan para la identificación de carcinomas, pero también se pueden expresar en algunos sarcomas. [12]
  • CD15 y CD30: utilizados para la enfermedad de Hodgkin .
  • Alfafetoproteína : para tumores del saco vitelino y carcinoma hepatocelular .
  • CD117 (KIT): para tumores del estroma gastrointestinal (GIST) y tumores de mastocitos.
  • CD10 (CALLA): para carcinoma de células renales y leucemia linfoblástica aguda .
  • Antígeno prostático específico (PSA): para el cáncer de próstata .
  • La tinción de estrógenos y receptores de progesterona (ER & PR) se usa tanto para el diagnóstico (tumores de mama y ginecológicos) como para el pronóstico en el cáncer de mama y para predecir la respuesta a la terapia (receptor de estrógeno).
  • Identificación de linfomas de células B mediante CD20 .
  • Identificación de linfomas de células T mediante CD3 .
Tinción PIN-4 de una glándula benigna (izquierda) y adenocarcinoma de próstata (derecha) utilizando el cóctel PIN-4. El adenocarcinoma carece de las células epiteliales basales (teñidas de marrón oscuro por p63 , CK-5 y CK-14 ). Además, en las muestras teñidas con PIN-4, las células de adenocarcinoma generalmente muestran citoplasmas rojos (teñidos por AMACR ).
  • Cóctel PIN-4, dirigido a p63 , CK-5 , CK-14 y AMACR (este último también conocido como P504S), y se utiliza para distinguir el adenocarcinoma de próstata de las glándulas benignas.

Dirigir la terapia [ editar ]

Una variedad de vías moleculares se alteran en el cáncer y algunas de las alteraciones pueden dirigirse a la terapia del cáncer. La inmunohistoquímica se puede utilizar para evaluar qué tumores probablemente responderán a la terapia, detectando la presencia o niveles elevados de la diana molecular.

Inhibidores químicos [ editar ]

La biología tumoral permite una serie de posibles dianas intracelulares. Muchos tumores dependen de las hormonas. La presencia de receptores hormonales puede usarse para determinar si un tumor responde potencialmente a la terapia antihormonal. Una de las primeras terapias fue el antiestrógeno, el tamoxifeno , que se usa para tratar el cáncer de mama. Estos receptores hormonales pueden detectarse mediante inmunohistoquímica. [13] El imatinib , un inhibidor de la tirosina quinasa intracelular , se desarrolló para tratar la leucemia mielógena crónica , una enfermedad caracterizada por la formación de una tirosina quinasa anormal específica. Imitanib ha demostrado ser eficaz en tumores que expresan otras tirosina quinasas, sobre todo KIT. La mayoría de los tumores del estroma gastrointestinalexpress KIT, que puede detectarse mediante inmunohistoquímica. [14]

Anticuerpos monoclonales [ editar ]

Artículo principal: terapia con anticuerpos monoclonales

Muchas proteínas que han demostrado estar altamente reguladas al alza en estados patológicos por inmunohistoquímica son objetivos potenciales para terapias que utilizan anticuerpos monoclonales . Los anticuerpos monoclonales, debido a su tamaño, se utilizan contra los objetivos de la superficie celular. Entre las dianas sobreexpresadas se encuentran miembros de la familia EGFR , proteínas transmembrana con un dominio receptor extracelular que regula una tirosina quinasa intracelular. [15] De estos, HER2 / neu (también conocido como Erb-B2) fue el primero en desarrollarse. La molécula está altamente expresada en una variedad de tipos de células cancerosas, sobre todo en el cáncer de mama. Como tal, los anticuerpos contra HER2 / neu han sido aprobados por la FDA para el tratamiento clínico del cáncer con el nombre de fármaco Herceptin.. Existen pruebas inmunohistoquímicas disponibles comercialmente, Dako HercepTest, Leica Biosystems Oracle [16] y Ventana Pathway. [17]

De manera similar, EGFR (HER-1) se sobreexpresa en una variedad de cánceres que incluyen cabeza y cuello y colon. La inmunohistoquímica se utiliza para determinar los pacientes que pueden beneficiarse de anticuerpos terapéuticos como Erbitux (cetuximab). [18] Los sistemas comerciales para detectar EGFR por inmunohistoquímica incluyen el Dako pharmDx.

Mapeo de la expresión de proteínas [ editar ]

La inmunohistoquímica también se puede utilizar para un perfil de proteínas más general, siempre que se disponga de anticuerpos validados para inmunohistoquímica. El Atlas de proteínas humanas muestra un mapa de la expresión de proteínas en órganos y tejidos humanos normales. La combinación de inmunohistoquímica y micromatrices de tejidos proporciona patrones de expresión de proteínas en un gran número de tipos de tejidos diferentes. La inmunohistoquímica también se utiliza para la elaboración de perfiles de proteínas en las formas más comunes de cáncer humano. [19] [20]

Ver también [ editar ]

  • Condiciones cutáneas con hallazgos de inmunofluorescencia
  • Hibridación cromogénica in situ

Referencias [ editar ]

  1. ^ a b c Ramos-Vara, JA; Miller MA (2014). "Cuando los antígenos y los anticuerpos de los tejidos se llevan bien: revisando los aspectos técnicos de la inmunohistoquímica - la técnica del rojo, marrón y azul" . Patología veterinaria . 51 (1): 42–87. doi : 10.1177 / 0300985813505879 . PMID  24129895 .
  2. ^ Coons AH, Creech HJ, Jones RN: Propiedades inmunológicas de un anticuerpo que contiene un grupo fluorescente. Proc Soc Exp Biol Med 1941; 47: 200-202.
  3. ↑ a b c d e f g Ramos-Vara, JA (2005). "Aspectos técnicos de la inmunohistoquímica" . Patología veterinaria . 42 (4): 405–426. doi : 10.1354 / vp.42-4-405 . PMID 16006601 . 
  4. ^ Whiteside, G; Munglani, R (1998). "Triple etiquetado de TUNEL, Hoechst e inmunohistoquímica: un método mejorado para la detección de apoptosis en secciones de tejido: una actualización". Protocolos de investigación cerebral . 3 (1): 52–53. doi : 10.1016 / s1385-299x (98) 00020-8 . PMID 9767106 . 
  5. ^ AbD Serotec. "Consejo 1 de IHC: Recuperación de antígenos: ¿debo hacer PIER o HIER?" . AbD Serotec . Archivado desde el original el 23 de abril de 2016 . Consultado el 26 de mayo de 2015 .
  6. ↑ Pohanka, Miroslav (2009). "Producción de anticuerpos monoclonales y policlonales - preparación de un potente elemento de biorreconocimiento" (PDF) . J Appl Biomed . 7 (3): 115-121. doi : 10.32725 / jab.2009.012 . Archivado desde el original (PDF) el 18 de abril de 2017 . Consultado el 18 de abril de 2017 .
  7. ^ Coventry, BJ; Bradley, J; Skinner, JM (julio de 1995). "Diferencias entre inmunohistología estándar y de alta sensibilidad en secciones de tejido - comparación de métodos de tinción de inmunoperoxidasa utilizando técnicas de análisis de imágenes de video computarizado". Patología . 27 (3): 221–3. doi : 10.1080 / 00313029500169013 . PMID 8532386 . 
  8. ↑ Torlakovic, Emina E .; Cheung, Carol C .; d'Arrigo, Corrado; Dietel, Manfred; Francis, Glenn D .; Gilks, C. Blake; Hall, Jacqueline A .; Hornick, Jason L .; Ibrahim, Merdol; Marchetti, Antonio; Miller, Keith; Van Krieken, J. Han; Nielsen, Soren; Swanson, Paul E .; Vyberg, Mogens; Zhou, Xiaoge; Taylor, Clive R. (2017). "Evolución de la garantía de calidad para la inmunohistoquímica clínica en la era de la medicina de precisión - Parte 2". Inmunohistoquímica aplicada y morfología molecular . 25 (2): 79–85. doi : 10.1097 / PAI.0000000000000444 . hdl : 2066/173083 . PMID 28182587 . 
  9. ^ O'Malley F y Pinder S, Patología mamaria, 1er. Ed. Elsevier 2006. ISBN 978-0-443-06680-1 
  10. ^ Zhu, S., Conrad, S. Hunt, J. Revisión y actualizaciones de inmunohistoquímica en tumores seleccionados de glándulas salivales y de cabeza y cuello. Premier de búsqueda académica.
  11. ^ Philippe, Taupin (2006). "Inmunohistoquímica BrdU para el estudio de la neurogénesis adulta: paradigmas, trampas, limitaciones y validación" . Reseñas de Brain Research . 53 (1): 198-214. doi : 10.1016 / j.brainresrev.2006.08.002 . PMID 17020783 . 
  12. ^ Líder M, Patel J, Makin C, Henry K (diciembre de 1986). "Un análisis de la sensibilidad y especificidad del marcador de citoqueratina CAM 5.2 para tumores epiteliales. Resultados de un estudio de 203 sarcomas, 50 carcinomas y 28 melanomas malignos". Histopatología . 10 (12): 1315–24. doi : 10.1111 / j.1365-2559.1986.tb02574.x . PMID 2434403 . 
  13. ^ Jørgensen, Jan Trøst; Kirsten Vang Nielsen; Bent Ejlertsen (abril de 2007). "Farmacodiagnóstico y terapias dirigidas: un enfoque racional para individualizar la terapia médica contra el cáncer en el cáncer de mama". El oncólogo . 12 (4): 397–405. doi : 10.1634 / theoncologist.12-4-397 . ISSN 1083-7159 . PMID 17470682 .  
  14. ^ Gold JS, Dematteo RP (agosto de 2006). "Terapia combinada quirúrgica y molecular: el modelo de tumor del estroma gastrointestinal" . Ana. Surg . 244 (2): 176–84. doi : 10.1097 / 01.sla.0000218080.94145.cf . PMC 1602162 . PMID 16858179 .  
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Enlaces externos [ editar ]

  • Atlas de proteínas humanas
  • Ramos-Vara JA, Miller MA (2014). "Cuando los antígenos y los anticuerpos de los tejidos se llevan bien: revisando los aspectos técnicos de la inmunohistoquímica - la técnica del rojo, marrón y azul" . Patología veterinaria . 51 (1): 42–87. doi : 10.1177 / 0300985813505879 . PMID  24129895 .
  • Descripción general de la inmunohistoquímica: describe todos los aspectos de la IHC, incluida la preparación de muestras, la tinción y la resolución de problemas.
  • Tinción inmunofluorescente de tejido incluido en parafina (IF-P)
  • Consejo 1 de IHC: Recuperación de antígenos: ¿debo hacer PIER o HIER?
  • Métodos de tinción histoquímica - Departamento de Patología de la Universidad de Rochester
  • Protocolo de tinción de inmunohistoquímica
  • Burnett R, Guichard Y, Barale E (1997). "Inmunohistoquímica para microscopía óptica en la evaluación de la seguridad de agentes terapéuticos: una descripción general". Toxicología . 119 (1): 83–93. doi : 10.1016 / S0300-483X (96) 03600-1 . PMID  9129199 .
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  • Joyner, A .; Wall, N. (2008). "Inmunohistoquímica de embriones de ratón de montaje completo" . Protocolos de Cold Spring Harbor . 2008 (2): pdb.prot4820. doi : 10.1101 / pdb.prot4820 . PMID  21356665 .