La inmunocitoquímica ( ICC ) es una técnica de laboratorio común que se usa para visualizar anatómicamente la localización de una proteína o antígeno específico en las células mediante el uso de un anticuerpo primario específico que se une a él. El anticuerpo primario permite la visualización de la proteína bajo un microscopio de fluorescencia cuando está unido por un anticuerpo secundario que tiene un fluoróforo conjugado . ICC permite a los investigadores evaluar si las células de una muestra en particular expresan el antígeno [1] en cuestión. En los casos en que un inmunopositivoSe encuentra la señal, ICC también permite a los investigadores determinar qué compartimentos subcelulares expresan el antígeno.
Inmuno cito química frente a inmuno histo química
La inmunocitoquímica difiere de la inmunohistoquímica [2] en que la primera se realiza en muestras de células intactas a las que se les ha eliminado la mayor parte, si no toda, de la matriz extracelular circundante . [ cita requerida ] Esto incluye células individuales que se han aislado de un bloque de tejido sólido, células cultivadas dentro de un cultivo , células depositadas de una suspensión o células extraídas de un frotis . Por el contrario, las muestras inmunohistoquímicas son secciones de tejido biológico , donde cada célula está rodeada por una arquitectura de tejido y otras células que normalmente se encuentran en el tejido intacto. La inmunocitoquímica es una técnica que se utiliza para evaluar la presencia de una proteína o antígeno específico en las células (células cultivadas, suspensiones celulares) mediante el uso de un anticuerpo específico, que se une a él, lo que permite la visualización y el examen al microscopio. Es una herramienta valiosa para la determinación del contenido celular de células individuales. Las muestras que se pueden analizar incluyen frotis de sangre, aspirados, hisopos, células cultivadas y suspensiones celulares.
Hay muchas formas de preparar muestras de células para el análisis inmunocitoquímico. Cada método tiene sus propias fortalezas y características únicas, por lo que se puede elegir el método correcto para la muestra y el resultado deseados.
Las células que se van a teñir se pueden unir a un soporte sólido para permitir un fácil manejo en los procedimientos posteriores. Esto se puede lograr mediante varios métodos: las células adherentes se pueden cultivar en portaobjetos de microscopio, cubreobjetos o un soporte plástico ópticamente adecuado. Las células en suspensión se pueden centrifugar en portaobjetos de vidrio ( cytospin ), unirlas a un soporte sólido mediante enlazadores químicos o, en algunos casos, manipularlas en suspensión.
Las suspensiones celulares concentradas que existen en un medio de baja viscosidad son buenos candidatos para las preparaciones de frotis. Las suspensiones de células diluidas existentes en un medio diluido son las más adecuadas para la preparación de citoespinas mediante citocentrifugación. Las suspensiones de células que existen en un medio de alta viscosidad son las más adecuadas para ser probadas como preparaciones de hisopos. La constante entre estas preparaciones es que la célula completa está presente en la superficie del portaobjetos. Para que tenga lugar cualquier reacción intercelular, la inmunoglobulina debe atravesar primero la membrana celular que está intacta en estas preparaciones. Las reacciones que tienen lugar en el núcleo pueden ser más difíciles y los fluidos extracelulares pueden crear obstáculos únicos en el desempeño de la inmunocitoquímica. En esta situación, es necesario permeabilizar las células con detergente (Triton X-100 o Tween-20) o elegir fijadores orgánicos (acetona, metanol o etanol).
Los anticuerpos son una herramienta importante para demostrar tanto la presencia como la localización subcelular de un antígeno. La tinción celular es una técnica muy versátil y, si el antígeno está muy localizado, puede detectar tan solo mil moléculas de antígeno en una célula. En algunas circunstancias, la tinción celular también puede usarse para determinar la concentración aproximada de un antígeno, especialmente mediante un analizador de imágenes.
Métodos
Existen muchos métodos para obtener la detección inmunológica en tejidos, incluidos los vinculados directamente a anticuerpos primarios o antisueros. Un método directo implica el uso de una etiqueta detectable (p. Ej., Molécula fluorescente, partículas de oro, etc.) directamente al anticuerpo [3] que luego se permite que se una al antígeno (p. Ej., Proteína) en una célula.
Alternativamente, existen muchos métodos indirectos . En uno de tales métodos, el antígeno se une a un anticuerpo primario que luego se amplifica mediante el uso de un anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario. A continuación, se aplica un reactivo terciario que contiene un resto enzimático y se une al anticuerpo secundario. Cuando se aplica el reactivo cuaternario, o sustrato, el extremo enzimático del reactivo terciario convierte el sustrato en un producto de reacción de pigmento, que produce un color (son posibles muchos colores; marrón, negro, rojo, etc.) en el mismo ubicación en la que el anticuerpo primario original reconoció ese antígeno de interés.
Algunos ejemplos de sustratos utilizados (también conocidos como cromógenos) son AEC (3-Amino-9-EthylCarbazole) o DAB ( 3,3'-Diaminobencidine ). El uso de uno de estos reactivos después de la exposición a la enzima necesaria (p. Ej., Peroxidasa de rábano picante conjugada con un reactivo de anticuerpo) produce un producto de inmunorreacción positivo. La visualización inmunocitoquímica de antígenos específicos de interés se puede usar cuando no se puede usar una tinción menos específica como H&E (hematoxilina y eosina) para realizar un diagnóstico o para proporcionar información predictiva adicional con respecto al tratamiento (en algunos cánceres, por ejemplo).
Alternativamente, el anticuerpo secundario puede unirse covalentemente a un fluoróforo ( FITC y rodamina son los más comunes) que se detecta en un microscopio de fluorescencia o confocal. La ubicación de la fluorescencia variará según la molécula diana, externa para las proteínas de membrana e interna para las proteínas citoplasmáticas. De esta forma la inmunofluorescencia es una técnica poderosa cuando se combina con microscopía confocal para estudiar la localización de proteínas y procesos dinámicos ( exocitosis , endocitosis , etc.).
Referencias
- ^ W. Burry, Richard (2010). Inmunocitoquímica . Springer, Nueva York, NY. págs. 7 –16. ISBN 978-1-4419-1304-3.
- ^ Renshaw, Simon (2017). Inmunohistoquímica e inmunocitoquímica: métodos esenciales, segunda edición . John Wiley & Sons, Ltd. págs. 35–102.
- ^ Cooper, Mark; Lummas, Sheriden (2016). Inmunohistoquímica e inmunocitoquímica: métodos esenciales, segunda edición . John Wiley & Sons, Ltd. págs. 21–23.