Las pruebas de toxicidad in vitro son el análisis científico de los efectos de sustancias químicas tóxicas en bacterias cultivadaso células de mamíferos . Los métodos de prueba in vitro (literalmente 'en vidrio') se emplean principalmente para identificar productos químicos potencialmente peligrosos y / o confirmar la falta de ciertas propiedades tóxicas en las primeras etapas del desarrollo de nuevas sustancias potencialmente útiles, como medicamentos terapéuticos, productos químicos agrícolas y aditivos alimentarios.
Los ensayos in vitro de toxicidad xenobiótica han sido considerados cuidadosamente recientemente por agencias gubernamentales clave (por ejemplo, EPA; NIEHS / NTP; FDA), para evaluar mejor los riesgos humanos. Existen actividades sustanciales en el uso de sistemas in vitro para avanzar en la comprensión mecanicista de las actividades tóxicas y el uso de células y tejidos humanos para definir los efectos tóxicos específicos de los seres humanos. [1]
Mejora con respecto a la experimentación con animales
La mayoría de los toxicólogos creen que los métodos de prueba de toxicidad in vitro pueden ser más útiles, más rápidos y rentables que los estudios de toxicología en animales vivos [2] (que se denominan métodos in vivo o "en vida"). Sin embargo, la extrapolación de in vitro a in vivo requiere una consideración cuidadosa y es un área de investigación activa.
Debido a las limitaciones reglamentarias y las consideraciones éticas, la búsqueda de alternativas a la experimentación con animales ha cobrado un nuevo impulso. En muchos casos, las pruebas in vitro son mejores que las pruebas en animales porque pueden usarse para desarrollar productos más seguros. [3]
La Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos estudió 1.065 sustancias químicas y farmacológicas en su programa ToxCast (parte del Panel de control de sustancias químicas CompTox ) utilizando modelos de sílice y un ensayo basado en células madre pluripotentes humanas para predecir intoxicantes del desarrollo in vivo en función de los cambios en el metabolismo celular después exposición a sustancias químicas. Los principales hallazgos del análisis de este conjunto de datos ToxCast_STM publicado en 2020 incluyen: (1) el 19% de 1065 productos químicos arrojaron una predicción de toxicidad para el desarrollo , (2) el rendimiento del ensayo alcanzó una precisión del 79% al 82% con alta especificidad (> 84%) pero sensibilidad modesta (<67%) en comparación con modelos animales in vivo de toxicidad para el desarrollo prenatal humano, (3) la sensibilidad mejoró a medida que se aplicaron pesos más estrictos de los requisitos de evidencia a los estudios con animales, y (4) análisis estadístico de la sustancia química más potente Los aciertos en objetivos bioquímicos específicos en ToxCast revelaron asociaciones positivas y negativas con la respuesta STM, proporcionando información sobre los fundamentos mecánicos del punto final objetivo y su dominio biológico. [4]
Ejemplos de ensayos de viabilidad celular (citotoxicidad) utilizados para toxicología in vitro
Existen muchos métodos de análisis para ensayar sustancias de prueba en cuanto a citotoxicidad y otras respuestas celulares.
MTT
El ensayo MTT se utiliza a menudo para determinar la viabilidad celular y ha sido validado para su uso por organizaciones internacionales. El ensayo MTT implica dos pasos: introducir el ensayo a los productos químicos y luego un paso de solubilización.
MTS
El ensayo in vitro colorimétrico MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2Htetrazolio) es una versión actualizada del método MTT validado, MTS El ensayo tiene la ventaja de ser soluble. Por tanto, no se requiere ningún paso de solubilización.
ATP
El ensayo de ATP tiene la principal ventaja de proporcionar resultados rápidamente (en 15 minutos) y solo requiere menos células de muestra. El ensayo realiza la lisis de las células y la siguiente reacción química entre el ensayo y el contenido de ATP de las células produce luminiscencia. La cantidad de luminiscencia se mide luego con un fotómetro y se puede traducir en un número de células vivas, ya que
- El ensayo de ATP asume que las células vivas todavía tienen ATP dentro de ellas, y
- El nivel de luminiscencia registrado es proporcional al contenido de ATP en las celdas de muestra.
Rojo neutro
Otro criterio de valoración de la viabilidad celular puede ser la captación de rojo neutro (NR). Rojo neutro, un colorante catiónico débil penetra las membranas celulares por no difusión y se acumula intercelularmente en los lisosomas. Las células viables absorben el tinte NR, las células dañadas o muertas no.
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
Los kits de ELISA se pueden utilizar para examinar la regulación ascendente y descendente de mediadores proinflamatorios como las citocinas (IL-1, TNF alfa, PGE2) ...
La medición de estos tipos de respuestas celulares puede ser una ventana a la interacción del artículo de prueba en los modelos de prueba (cultivos de células monocapa, modelos de tejido 3D, explantes de tejido).
Tipos de estudios in vitro
A grandes rasgos, existen dos tipos distintos de estudios in vitro en función del sistema de tipos desarrollado para realizar el experimento. Los dos tipos de sistemas generalmente utilizados son: a) Sistema de placa de pocillos estáticos yb) Sistemas perfundidos multicompartimentales.
Sistema de placa de pocillos estáticos
Los sistemas de capas o placas de pocillos estáticos son la forma más tradicional y simple de análisis ampliamente utilizada para el estudio in vitro. Estos ensayos son bastante beneficiosos, ya que son bastante simples y proporcionan un entorno de prueba muy accesible para controlar los productos químicos en el medio de cultivo y en la célula. Sin embargo, la desventaja de utilizar estos ensayos de placa de pocillos estáticos simples es que no pueden representar las interacciones celulares y las condiciones fisiológicas del flujo de fluidos que tienen lugar dentro del cuerpo.
Sistemas perfundidos multicompartimentales
Ahora se desarrollan nuevas plataformas de prueba para resolver problemas relacionados con las interacciones celulares. Estas nuevas plataformas son mucho más complejas basadas en sistemas perfundidos multicompartimentales. [5] El objetivo principal de estos sistemas es reproducir los mecanismos in vivo de manera más confiable al proporcionar un entorno de cultivo celular cercano a la situación in vivo. Cada compartimento del sistema representa un órgano específico del organismo vivo y, por tanto, cada compartimento tiene unas características y criterios específicos. Cada compartimento de estos sistemas está conectado por tubos y bombas a través de los cuales fluye el líquido, imitando así el flujo sanguíneo en la situación in vivo. El inconveniente del uso de estos sistemas perfundidos es que los efectos adversos (influencia de los componentes biológicos y no biológicos del sistema en el destino de la sustancia química en estudio) se comparan más con los sistemas estáticos. Para reducir el efecto de los componentes no biológicos del sistema, todos los compartimentos están hechos de vidrio y los tubos de conexión están hechos de teflón. Se han propuesto varios modelos cinéticos para cuidar de estas uniones inespecíficas que tienen lugar en estos sistemas in vitro. [6]
Para mejorar las dificultades biológicas derivadas del uso de diferentes condiciones de cultivo in vitro, es necesario modificar los modelos tradicionales utilizados en matraces o placas de micropocillos. Con el desarrollo paralelo en micro-tecnologías e ingeniería de tejidos, estos problemas se resuelven utilizando nuevas herramientas pertinentes llamadas "biochips micro-fluídicos". [7]
Referencias
- ^ "Tox21" . Fuente: Agencia de Protección Ambiental de EE . UU . Consultado el 29 de octubre de 2011 .
- ^ Mahony, Catherine; Ashton, Randolph S .; Birk, Barbara; Boobis, Alan R .; Cull, Tom; Daston, George P .; Ewart, Lorna; Knudsen, Thomas B .; Manou, Irene; Maurer-Stroh, Sebastián; Margiotta-Casaluci, Luigi (julio de 2020). "Nuevas ideas para enfoques no animales para predecir la toxicidad sistémica de dosis repetidas: informe de un taller de cielo azul de la EPAA" . Toxicología regulatoria y farmacología . 114 : 104668. doi : 10.1016 / j.yrtph.2020.104668 .
- ^ "Visión y hoja de ruta para el siglo XXI" . Fuente: Programa Nacional de Toxicología . Consultado el 29 de octubre de 2011 .
- ^ Zurlinden, TJ; Saili, KS; Rush, N; Kothiya, P; Judson, RS; Houck, KA; Hunter, ES; Baker, Carolina del Norte; Palmer, JA; Thomas, RS; Knudson, TB (2020). "Perfilado de la biblioteca ToxCast con un ensayo de biomarcador basado en líneas de células madre humanas pluripotentes (H9) para la toxicidad del desarrollo". Ciencias Toxicológicas . 174 (2): 189-209. PMID 32073639 .
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- ^ Ouattara DA; Choi S.-H .; Sakai Y .; Pery ARR; Brochot C. (2011). "Modelado cinético de ensayos basados en células in vitro para caracterizar enlaces no específicos y procesos ADME en un sistema fluídico estático y perfundido". Cartas de toxicología . 205 (3): 310–319. doi : 10.1016 / j.toxlet.2011.06.021 .
- ^ Baudoin R .; Corlu A .; Griscom L .; Legallais C .; Leclerc E. (2007). "Tendencias en el desarrollo de biochips de células microfluídicas para hepatotoxicidad in vitro". Toxicología in Vitro . 21 (4): 535–544. doi : 10.1016 / j.tiv.2006.11.004 .