En microbiología, el término aislamiento se refiere a la separación de una cepa de una población mixta natural de microbios vivos , tal como están presentes en el medio ambiente, por ejemplo en el agua o la flora del suelo , o de seres vivos con flora cutánea , oral o intestinal. , para identificar los microbios de interés. Históricamente, las técnicas de laboratorio de aislamiento se desarrollaron por primera vez en el campo de la bacteriología y la parasitología (durante el siglo XIX), antes que las de virología.durante el siglo XX. Los métodos de aislamiento microbiano han cambiado drásticamente en los últimos 50 años, desde una perspectiva laboral con una mecanización creciente, y con respecto a la tecnología involucrada y, por lo tanto, la velocidad y la precisión.
Historia
Las técnicas de laboratorio de aislamiento de microbios se desarrollaron por primera vez durante el siglo XIX en el campo de la bacteriología y la parasitología mediante microscopía óptica . No existían técnicas adecuadas de aislamiento de virología antes del siglo XX. Los métodos de aislamiento microbiano han cambiado drásticamente en los últimos 50 años, desde una perspectiva laboral con creciente mecanización, y en cuanto a las tecnologías involucradas, y con ello rapidez y precisión.
Técnicas generales
Para aislar un microbio de una población natural mixta de microbios vivos , como los presentes en el medio ambiente, por ejemplo en el agua o la flora del suelo , o de seres vivos con flora cutánea , oral o intestinal , hay que separarlo de la mezcla.
Tradicionalmente, los microbios se han cultivado para identificar los microbios de interés en función de sus características de crecimiento. Dependiendo de la densidad esperada y la viabilidad de los microbios presentes en una muestra líquida, se pueden elegir métodos físicos para aumentar el gradiente como, por ejemplo , dilución en serie o centrifugación . Para aislar organismos en materiales con alto contenido microbiano, como aguas residuales, tierra o heces, las diluciones en serie aumentarán la posibilidad de separar una mezcla.
En un medio líquido con pocos o ningún organismo esperado, de un área que normalmente es estéril (como LCR , sangre dentro del sistema circulatorio) centrifugar, decantar el sobrenadante y usar solo el sedimento aumentará la posibilidad de crecer y aislar bacterias o el generalmente virus asociados a células.
Si uno espera o busca un organismo particularmente exigente , el cultivo microbiológico y las técnicas de aislamiento deberán orientarse hacia ese microbio. Por ejemplo, una bacteria que muere cuando se expone al aire, solo puede aislarse si la muestra se transporta y procesa en condiciones anaeróbicas o sin aire. Una bacteria que muere cuando se expone a temperatura ambiente (termófila) requiere un contenedor de transporte precalentado, y un microbio que se seca y muere cuando se transporta en un hisopo de algodón necesitará un medio de transporte viral antes de que pueda cultivarse con éxito.
Cultivo de bacterias y hongos
Inoculación
Los técnicos de laboratorio inoculan la muestra en determinadas placas de agar sólido con el método de la placa estriada o en medio de cultivo líquido , según cuál sea el objetivo del aislamiento:
- Si se desea aislar solo un grupo particular de bacterias, como el estreptococo del grupo A de un frotis de garganta, se puede usar un medio selectivo que suprima el crecimiento de las bacterias concomitantes esperadas en la mezcla (por los antibióticos presentes en el agar), por lo que que sólo se "seleccionan" los estreptococos, es decir, se destacan visiblemente. Para aislar hongos, se puede utilizar agar Sabouraud . Alternativamente, las condiciones letales para las bacterias estreptococos y gram negativas como alta de sal concentraciones en sal manitol agar supervivencia favor de cualquier estafilococos presente en una muestra de las bacterias intestinales, y rojo de fenol en el agar actúa como un indicador de pH mostrando si las bacterias son capaces de fermentar manitol excretando ácido en el medio. En otros agar se añaden sustancias para aprovechar la capacidad de un organismo de producir un pigmento visible (por ejemplo, medio granada para estreptococos del grupo B ) que cambia el color de la colonia bacteriana , o para disolver el agar sangre por hemólisis para que puedan detectarse más fácilmente. Algunas bacterias como las especies de Legionella requieren nutrientes particulares o la unión de toxinas como en el carbón para crecer y, por lo tanto, se deben usar medios como el agar con extracto de levadura de carbón tamponado .
- Si se desea aislar tantas o todas las cepas posibles, se deben inocular diferentes medios nutritivos, así como medios enriquecidos, como agar sangre y agar chocolate, y medios de cultivo anaeróbicos como el caldo de tioglicolato . Para enumerar el crecimiento, las bacterias se pueden suspender en agar fundido antes de que se solidifique y luego verter en placas de Petri , el llamado 'método de vertido en placa' que se utiliza en microbiología ambiental y microbiología de alimentos (por ejemplo, pruebas de productos lácteos) para establecer el el llamado "recuento aeróbico en placa".
Incubación
Después de inocular la muestra en o sobre el medio elegido, se incuban en los entornos atmosféricos apropiados, como condiciones aeróbicas, anaeróbicas o microaerófilas o con dióxido de carbono añadido (5%), a diferentes configuraciones de temperatura, por ejemplo, 37 ° C en en una incubadora o en un refrigerador para enriquecimiento en frío, bajo luz adecuada, por ejemplo, estrictamente sin luz envuelto en papel o en una botella oscura para micobacterias scotocromógenas , y durante diferentes períodos de tiempo, porque diferentes bacterias crecen a una velocidad diferente, que varía de horas ( Escherichia coli ) a semanas (por ejemplo, micobacterias ).
A intervalos regulares, en serie, los técnicos de laboratorio y microbiólogos inspeccionan los medios en busca de signos de crecimiento visible y los registran. La inspección nuevamente tiene que ocurrir en condiciones que favorezcan la supervivencia del aislado, es decir, en una 'cámara anaeróbica' para bacterias anaerobias, por ejemplo, y en condiciones que no amenacen a la persona que mira las placas de ser infectada por un microbio particularmente infeccioso, es decir, bajo una cabina de seguridad biológica para Yersinia pestis (plaga) o Bacillus anthracis (ántrax), por ejemplo.
Identificación
Cuando las bacterias han crecido visiblemente, a menudo todavía están mezcladas. La identificación de un microbio depende del aislamiento de una colonia individual , ya que las pruebas bioquímicas de un microbio para determinar sus diferentes características fisiológicas dependen de un cultivo puro . Para hacer un subcultivo , se vuelve a trabajar en técnica aséptica en microbiología , levantando una sola colonia de la superficie del agar con un asa y esparciendo el material en los 4 cuadrantes de una placa de agar o por todas partes si la colonia era singular y no se veía mezclada. .
La tinción de Gram de la muestra cruda antes de la incubación o la tinción del material de la colonia recién crecido ayuda a determinar si una colonia consta de bacterias de apariencia uniforme o está mezclada, y el color y la forma de las bacterias permiten una primera clasificación basada en la morfología. En microbiología clínica se utilizan muchas otras técnicas de tinción para organismos particulares (tinción bacteriana acidorresistente para micobacterias). Se han desarrollado técnicas de tinción inmunológica, como la inmunofluorescencia directa, para patógenos de importancia médica que son de crecimiento lento ( tinción de auramina-rodamina para micobacterias) o difíciles de cultivar (como especies de Legionella pneumophila) y donde el resultado de la prueba alteraría el tratamiento estándar y la terapia empírica .
Las pruebas bioquímicas de bacterias implican un conjunto de agares en viales para separar las bacterias móviles de las inmóviles . En 1970 se desarrolló una versión miniaturizada, denominada índice de perfil analítico .
La identificación exitosa mediante, por ejemplo, secuenciación del genoma y genómica depende de cultivos puros.
Bacterias, independientes del cultivo
Si bien el método más rápido para identificar bacterias es secuenciando su gen de ARNr 16S , que ha sido amplificado por PCR de antemano, este método no requiere aislamiento. Dado que la mayoría de las bacterias no se pueden cultivar con métodos convencionales (particularmente bacterias ambientales o del suelo), se utilizan metagenómica o metatranscriptómica , secuenciación de escopeta o secuenciación dirigida por PCR del genoma . La secuenciación con espectrometría de masas como en la desorción / ionización láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) se utiliza en el análisis de muestras clínicas para buscar patógenos. La secuenciación del genoma completo es una opción para un organismo singular que no se puede caracterizar suficientemente para su identificación. También se pueden utilizar microarrays de ADN pequeños para la identificación.
Referencias
Manual de aplicación microbiológica de Benson 8a edición