El medio Granada es un medio de cultivo selectivo y diferencial diseñado para aislar selectivamente Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B, GBS) y diferenciarlo de otros microorganismos. Granada Medium fue desarrollado por el Dr. Manuel Rosa-Fraile et al. en el Servicio de Microbiología del Hospital Virgen de las Nieves de Granada (España). [1]
La identificación de GBS en medio de granada es sencilla y se basa en la detección de granadaene , un pigmento poliénico rojo específico de GBS. [2] [3] [4]
Composición [1]
Ingrediente | Monto | Función |
---|---|---|
Agar | 10g | Agente gelificante |
Peptona de proteosa n. ° 3 de Bacto ™, (Difco) BD | 25g | Nutriente específico, no puede ser sustituido por ninguna peptona alternativa. |
Almidón | 20g | Estabilizador de pigmentos |
Glucosa | 2,5 g | Nutritivo |
Suero de caballo | 15ml | Nutritivo |
MOPS (ácido 3- (N-morfolino) propanosulfónico) sal hemisódica | 11g | Buen tampón |
Fosfato de hidrógeno disódico | 8,5 g | Buffer |
Piruvato de sodio | 1 g | Fuente adicional de energía, efectos protectores contra especies reactivas de oxígeno. |
Sulfato de magnesio | 0,2 g | ------ |
Metotrexato | 6 mg | Potenciador de pigmentos |
Cristal violeta | 0,2 mg | Inhibe el crecimiento de bacterias grampositivas. |
Sulfato de colistina | 5 mg | Inhibe el crecimiento de bacterias gramnegativas. |
Metronidazol | 1 mg | Inhibir el crecimiento de bacterias anaeróbicas. |
Agua | 1000ml |
pH 7,45 ± 0,1
Antecedentes y principios
El medio Granada se desarrolló para el aislamiento selectivo y la identificación de GBS a partir de muestras clínicas. [1] La producción de un pigmento rojo ( granadaeno ) en medio de granada es exclusiva de los estreptococos β- hemolíticos del grupo B aislados de seres humanos. [5] El granadano es un pigmento poliénico no isoprenoide (ornitinrhamnododecano) con un sistema conjugado de 12 dobles enlaces. [3] [6] [7]
La β-hemólisis y la producción de pigmentos están codificadas en GBS por un grupo de genes de 12 genes, el grupo cyl . [8] [9] Además, se ha sugerido que el pigmento de GBS y la hemolisina son moléculas idénticas o estrechamente relacionadas y también se ha informado que son factores importantes que contribuyen a la virulencia de GBS. [5] [10] [11] Sin embargo, del 1 al 5% de las cepas de GBS no son hemolíticas y no producen pigmento. [5] sin embargo, estas cepas de GBS no hemolíticas y no pigmentadas (que carecen de pigmento y hemolisina) son considerado menos virulento. [10] [11] [12] [13] [14] [15]
Componentes
El agar Granada consiste principalmente en un agar proteosa- peptona- almidón tamponado con MOPS (un tampón de Good ) y fosfato y complementado con metotrexato y antibióticos. [1] La proteosa peptona, el suero de caballo, la glucosa y el piruvato de sodio proporcionan nutrientes para el crecimiento de Streptococcus agalactiae , el piruvato de sodio también proporciona un efecto protector contra las especies reactivas de oxígeno (ROS). MOPS y fosfato tamponan el medio. El metotrexato desencadena la producción de pigmento [5] y el almidón estabiliza el pigmento. [5] El suplemento selectivo contiene los antibióticos, colistina (inhibidor de bacterias gramnegativas) y metronidazol (inhibidor de bacterias anaeróbicas) y violeta cristal para suprimir las bacterias grampositivas acompañantes.
Un componente clave del medio de Granada es Proteose Peptone N3 (Difco & BD). Esta peptona pépsica fue desarrollada por DIFCO (Digestive Ferments Company) durante la Primera Guerra Mundial para producir toxinas bacterianas para la producción de vacunas. [16] Para el desarrollo de colonias de ladrillo rojo de GBS en medio de granada es necesaria la presencia del péptido Ile-Ala-Arg-Arg-His-Pro-Tyr-Phe en el medio de cultivo. Este péptido solo se produce durante la hidrólisis con pepsina de albúmina de mamífero. [17] Para una producción óptima de pigmento también es necesaria la presencia en la peptona de otras sustancias (no caracterizadas en la actualidad) de los tejidos de la pared gastrointestinal de los mamíferos que se utilizan para preparar algunas peptonas. [18] La presencia de almidón es un requisito básico para estabilizar el pigmento que permite el desarrollo de colonias rojas de GBS. [5] No obstante, si se usa almidón soluble, se obtiene un medio de cultivo que se deteriora rápidamente a temperatura ambiente porque el almidón soluble es hidrolizado por la amilasa sérica (añadida como suplemento). Este inconveniente se puede solucionar sin utilizar suero o utilizando almidones no modificados para preparar el medio de cultivo, porque los almidones no modificados son más resistentes a la acción hidrolítica de la amilasa. [19]
Usos
El GBS crece en agar granada como colonias de color rosa-rojo después de 18-48 horas de incubación (35-37 ° C), se obtienen mejores resultados en anaerobiosis (cultivo en un ambiente anaeróbico). [1] El agar Granada se utiliza para el aislamiento primario, la identificación y el cribado del SGB β-hemolítico a partir de muestras clínicas. [2] [4]
Este medio de cultivo es selectivo para GBS, sin embargo otros microorganismos (como enterococos y levaduras ), resistentes a los agentes selectivos utilizados, pueden desarrollarse como colonias incoloras o blancas. [2]
El agar Granada es útil para el cribado de mujeres embarazadas para la detección de colonización vaginal y rectal con GBS para usar profilaxis antibiótica intraparto para evitar la infección por GBS de inicio temprano en el recién nacido. [20] [21] [22]
Procedimiento
Las muestras se pueden sembrar directamente en una placa de agar granada o después de un paso de enriquecimiento para obtener el máximo aislamiento. [20] Las muestras se deben sembrar en estrías lo antes posible después de su recepción en el laboratorio. Si se está cultivando material de un hisopo (por ejemplo, de un hisopo vaginal o vagino-rectal), enrolle el hisopo directamente sobre la placa de agar para proporcionar una exposición adecuada del hisopo al medio para una máxima transferencia de organismos.
Coloque el cultivo en un ambiente anaeróbico, incube a 35-37 ° C y examínelo después de la incubación durante la noche y nuevamente después de aproximadamente 48 horas. [1]
Para aumentar la recuperación de GBS, los hisopos también se pueden inocular previamente en un medio de caldo de enriquecimiento selectivo, como el caldo Todd-Hewitt suplementado con gentamicina o colistina y ácido nalidíxico e incubarse durante 18-24 horas a 35-37 ° C. [20] [22] [23] [24]
Resultados
Las colonias de GBS β-hemolítico aparecen en el medio de granada como colonias rosadas o rojas, y se distinguen fácilmente de otros microorganismos que también pueden haber crecido en la placa. Cualquier grado de desarrollo de naranja debe considerarse indicativo de una colonia de GBS y no son necesarias más pruebas de identificación. [2] El GBS no β-hemolítico se desarrolla en agar granada como colonias blancas que, si es necesario, pueden someterse a pruebas adicionales mediante aglutinación con látex o la prueba CAMP . [20] [21]
Variante
Las placas de agar Granada también se pueden incubar aeróbicamente siempre que se coloque un cubreobjetos sobre el inóculo en la placa. [2] El medio de Granada también se puede utilizar como caldo de Granada [21] (caldo bifásico de Granada [25] y caldo de zanahoria Strep B [26] ). Cuando se utilizan medios líquidos de granada, la incubación anaeróbica no es necesaria. [2]
Granadaene y Streptococcus agalactiae
La β-hemólisis y la producción de pigmento (granadaeno) están codificadas en GBS por un grupo de genes de 12 genes, el grupo cyl . [8] [9] Además, se ha sugerido que el pigmento de GBS y la hemolisina son moléculas idénticas o estrechamente relacionadas y también se ha informado que son factores importantes que contribuyen a la virulencia de GBS. [5] [10] [11] Sin embargo, del 1 al 5% de las cepas de GBS no son hemolíticas y no producen pigmento. [5] sin embargo, estas cepas de GBS no hemolíticas y no pigmentadas (que carecen de pigmento y hemolisina) son considerado menos virulento. [10] [11] [12] [13] [14] [15]
Referencias
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