Un ácido nucleico bloqueado ( LNA ), también conocido como ácido nucleico en puente (BNA), [1] y a menudo denominado ARN inaccesible , es un nucleótido de ARN modificado en el que el resto de ribosa se modifica con un puente adicional que conecta el oxígeno 2 ' y 4 'de carbono. El puente "bloquea" la ribosa en la conformación 3'- endo (norte), que a menudo se encuentra en los dúplex en forma de A. Esta estructura se puede atribuir a la mayor estabilidad frente a la degradación enzimática; [2] [3] [4] [5]además, la estructura de LNA tiene una especificidad y afinidad mejoradas como monómero o constituyente de un oligonucleótido. [6] Los nucleótidos de LNA se pueden mezclar con residuos de ADN o ARN en el oligonucleótido, hibridando de hecho con ADN o ARN de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases de Watson-Crick.
Síntesis
Obika y col. fueron los primeros en sintetizar químicamente LNA en 1997, [7] seguidos independientemente por el grupo de Jesper Wengel en 1998. [8] Esto se hizo posible después de que Zamecnick y Stephenson sentaron las bases sobre la posibilidad de que los oligonucleótidos fueran grandes agentes para controlar la expresión génica en 1978. [9] Hasta la fecha, se ha demostrado que dos enfoques diferentes, denominados estrategias lineales y convergentes respectivamente, producen LNA de alto rendimiento y eficiencia. La estrategia lineal de síntesis se detalló por primera vez en los trabajos de Obika et al. [7] En este enfoque, se puede usar uridina (o cualquier nucleósido de ARN fácilmente disponible ) como material de partida. La estrategia convergente requiere la síntesis de un azúcar intermedio que sirva como donante de glicosilo necesario para el acoplamiento con nucleobases . Comúnmente, la D-glucosa se usa para producir el azúcar intermedio que posteriormente se hace reaccionar con nucleobases usando un procedimiento de Vorbrügen modificado que permite el acoplamiento estereoselectivo. [10]
La adición de diferentes fracciones sigue siendo una posibilidad con el mantenimiento de propiedades fisicoquímicas clave como la alta afinidad y especificidad evidente en el LNA sintetizado originalmente. [8] Estos oligómeros se sintetizan químicamente y están disponibles comercialmente.
LNAzimas (ADNzimas modificadas con LNA )
Las LNAzimas son generalmente endonucleasas que se unen a secuencias diana de ARN específicas y escinden el enlace fosfodiéster que existe entre los nucleótidos. [11] Se han convertido en un método destacado para aplicaciones terapéuticas y biotecnológicas debido a su bioestabilidad en comparación con los ácidos nucleicos biológicos . Comúnmente conocidos como LNAzimas, los investigadores han desarrollado oligonucleótidos modificados con LNA y han demostrado una hibridación notable con ARN , ssDNA y dsDNA y facilitan la reparación de errores de apareamiento en el ADN natural. [12] Con respecto a la actividad catalítica de las LNAzimas, se ha registrado una escisión más eficiente de los enlaces fosfodiéster en los sustratos de ARN en comparación con las ADNzimas . [13] La modificación de los brazos de reconocimiento de sustrato de ADNzimas con monómeros de LNA produce una LNAzima que reconoce el coxsackievirus A21 (CAV-21) y escinde su secuencia diana de ARN similar a una en la región 5 'no traducida (5' UTR) del rinovirus humano -14 (HRV-14); una secuencia no reconocida por ADNzimas no modificadas. [14]
Aplicaciones en Terapéutica y Biotecnología
Los oligonucleótidos modificados con LNA son una opción prometedora en el desarrollo de terapias debido a su alta estabilidad en entornos biológicos e hibridación preferencial. El uso terapéutico de oligonucleótidos basados en LNA es un campo emergente en biotecnología . [15] Se ha evaluado una variedad de oligonucleótidos LNA por sus perfiles farmacocinéticos y de toxicidad. Los estudios concluyeron que la toxicidad del LNA es generalmente independiente de la secuencia de oligonucleótidos y muestra un perfil de seguridad preferencial para aplicaciones terapéuticas traducibles. [8] La PCR específica de alelos que utiliza LNA permite el diseño de cebadores más cortos, sin comprometer la especificidad de unión. [16] Además, el LNA se ha incorporado en la hibridación in situ por fluorescencia (FISH) . [17] FISH es una técnica común utilizada para visualizar material genético en una variedad de células, sin embargo, estudios previos señalan que esta técnica se ha visto limitada por la baja eficiencia de hibridación de la sonda. Por el contrario, las sondas incorporadas con LNA demostraron una mayor eficiencia de hibridación tanto en el ADN como en el ARN . La eficiencia mejorada de FISH con LNA incorporado ha dado como resultado un análisis FISH exitoso del cromosoma humano, varios tipos de células no humanas y microarreglos. Ensayos de genotipificación de LNA han llevado a cabo, así, específicamente para detectar una mutación en la apolipoproteína B . [17] Se ha investigado el LNA por sus propiedades terapéuticas en el tratamiento de cánceres y enfermedades infecciosas. Se ha desarrollado una nueva molécula antisentido de fosforotioato de ácido nucleico bloqueado, denominada SPC2996, para dirigirse al ARNm que codifica la oncoproteína Bcl-2, una proteína que inhibe la apoptosis en las células de leucemia linfocítica crónica (LLC). Los ensayos clínicos de fase I y II demostraron una reducción dependiente de la dosis en las células de CLL circulantes en aproximadamente el 30% de la población de la muestra; sin embargo, las limitaciones y los costos de este ensayo impulsan una mayor investigación del SPC2996. [18] También se ha aplicado LNA a Miravirsen , un fármaco experimental destinado al tratamiento de la hepatitis C , que constituye una secuencia de fosforotioato de 15 nucleótidos con especificidad de unión para MiR-122 (un miRNA expresado en hepatocitos ). [19] [20] Nuevas aplicaciones de LNA podrían mejorar muchas formas de ADN y, de hecho, agregarse a enzimas o fármacos como mecanismo de regulación. El LNA ha demostrado ser prometedor en la terapia génica por su potencial para regular la expresión génica, pero ha mostrado resultados mixtos en estudios antisentido. [15] Debido a su alta afinidad por la discriminación de desajustes, el LNA se ha estudiado para sus aplicaciones en herramientas de diagnóstico. Las sondas de LNA inmovilizadas se han introducido con éxito en un ensayo de genotipado de SNP múltiple , una indicación de que los diagnósticos incorporados con LNA pueden surgir en el mercado en el futuro. [15]
Referencias
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