La proteína de unión a maltosa ( MBP ) es parte del sistema maltosa / maltodextrina de Escherichia coli , que es responsable de la captación y catabolismo eficiente de las maltodextrinas. Es un sistema de transporte y regulador complejo que involucra muchas proteínas y complejos de proteínas. MBP tiene una masa molecular aproximada de 42,5 kilodaltons .
Proteína periplásmica de unión a maltosa / maltodextrina | ||||||
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Identificadores | ||||||
Organismo | ||||||
Símbolo | Masculino | |||||
UniProt | P0AEX9 | |||||
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Estructura y plegado
La MBP está codificada por el gen malE de Escherichia coli . El gen malE codifica un polipéptido precursor (396 residuos de aminoácidos) que produce la MBP madura (370 residuos) tras la escisión de la extensión del terminal NH 2 (26 residuos). Las formas precursoras y maduras de MBP no contienen residuos de cisteína . [2]
MBP es una proteína monomérica. Las estructuras cristalinas han demostrado que la MBP se divide en dos dominios globulares distintos que están conectados por tres segmentos polipeptídicos cortos. Los dos dominios están separados por un surco profundo que contiene el sitio de unión de maltosa / maltodextrina. La comparación de las estructuras de las formas ligadas y no ligadas de MBP ha demostrado que la unión de maltosa induce un cambio conformacional importante que cierra el surco mediante un movimiento rígido de los dos dominios alrededor de la bisagra del polipéptido de unión. [3] [4]
Tanto la forma precursora como la madura de MBP son funcionales para la unión de maltosa. [5] La extensión del terminal NH 2 disminuye la tasa de plegado de la forma precursora de MBP en relación con su forma madura en al menos 5 veces, pero no tiene ningún efecto sobre la velocidad de despliegue. [6] [7] El despliegue de equilibrio de MBP puede modelarse mediante un mecanismo de dos estados con una estabilidad ∆G (H 2 O) igual a 9,45 kcal mol -1 a 25 ° C, pH 7,6. [8]
Localización y exportación
MBP se exporta al espacio periplásmico de E. coli . [9] La extensión NH 2 terminal de MBP, también denominada péptido señal , tiene dos funciones: (i) ralentiza el plegamiento del polipéptido recién sintetizado y (ii) dirige este polipéptido a la membrana y al translocón SecYEG . Una vez plegado, el precursor ya no puede entrar en la vía de translocación. [10] La introducción de un residuo de aminoácido cargado o un residuo de prolina dentro del núcleo hidrófobo del péptido señal es suficiente para bloquear la exportación. [11] Las exportaciones defectuosas de las MBP mutantes son consistentes con la conformación alfa-helicoidal y las interacciones hidrófobas del péptido señal en su interacción con la proteína motora translocónica SecA . [12] [13] [14]
Control de expresión
El gen malE , que codifica MBP, pertenece al regulón Mal de E. coli , que consta de diez genes cuyos productos están orientados a la captación y utilización eficiente de maltosa y maltodextrinas . Todos los genes implicados en el transporte de maltosa / maltodextrina, incluido malE , se agrupan en la región malB de E. coli y se organizan en dos operones divergentes : malE-malF-malG y malK-lamB . [15] Los sitios de inicio de la transcripción en los promotores malEp y malKp están distantes de 271 pares de bases. [dieciséis]
Los promotores malEp y malKp son activados sinérgicamente por la proteína MalT, el activador del regulón Mal y por la proteína CRP del receptor cAMP . Esta activación es un proceso acoplado que implica, desde malEp hacia malKp : dos sitios de unión a MalT; tres sitios de unión a CRP y dos conjuntos superpuestos de tres sitios de unión a MalT, escalonados por tres pares de bases. [16] [17] [18] La activación de la transcripción requiere la unión de trifosfato de adenosina (ATP) y maltotriosa a MalT y la unión de AMP cíclico al dímero de CRP. [19] La forma no ligada de MalT es monomérica mientras que su forma ligada, en presencia de ATP y maltotriosa, es oligomérica. [20]
Utilizar como vector de proteínas y péptidos
La MBP se usa para aumentar la solubilidad de proteínas recombinantes expresadas en E. coli . En estos sistemas, la proteína de interés a menudo se expresa como una proteína de fusión de MBP , lo que evita la agregación de la proteína de interés. El mecanismo por el cual MBP aumenta la solubilidad no se comprende bien. Además, la MBP se puede usar por sí misma como una etiqueta de afinidad para la purificación de proteínas recombinantes. La proteína de fusión se une a las columnas de amilosa mientras que todas las demás proteínas fluyen. La fusión de MBP-proteína se puede purificar eluyendo la columna con maltosa. Una vez que la proteína de fusión se obtiene en forma purificada, la proteína de interés a menudo se escinde de MBP con una proteasa específica y luego se puede separar de MBP mediante cromatografía de afinidad .
Se realizó un primer estudio de las relaciones entre la estructura y las funciones de MBP mediante la inserción aleatoria de un fragmento de ADN corto, que codifica un sitio de restricción BamHI , en el gen malE . Algunas de las inserciones afectaron las funciones de MBP mientras que otras fueron permisivas. [21] [22] Los sitios permisivos que eran internos a MBP, se usaron para insertar péptidos antigénicos y desafiar la respuesta inmune en ratones. [23] Las inserciones terminales 3'-OH se utilizaron para crear proteínas de fusión y desarrollar el uso de MBP como un asa de afinidad para la purificación de proteínas y péptidos extraños mediante cromatografía de afinidad en amilosa reticulada y elución con maltosa en una sustancia física suave. condiciones químicas. [24] [25] Se desarrollaron varios vectores plásmidos para facilitar la expresión y purificación de tales proteínas de fusión. [26]
Cuando la MBP recombinante incluye un péptido señal , la proteína de fusión se puede exportar al espacio periplásmico , lo que facilita su purificación ya que el líquido periplásmico contiene solo un número limitado de proteínas y se puede recuperar por choque osmótico o por permeabilización de la bacteria. membrana externa con antibióticos tales como polimixina B . Tal exportación de la proteína de fusión al espacio periplásmico permite la formación de enlaces disulfuro en la proteína pasajera, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos . [27] [28] Las proteínas extrañas que se exportan o secretan en su organismo nativo, por lo general se pueden exportar al periplasma de E. coli por fusión con MBP. Ejemplos de proteínas citoplasmáticas que podrían exportarse mediante fusión con MBP incluyen la polimerasa Klenow monomérica y la proteína dímera del Gene V del fago M13 . [24] [29] Cuando la MBP recombinante incluye un péptido defectuoso o sin señal, la proteína de fusión permanece dentro del citoplasma bacteriano desde donde se puede recuperar rompiendo las células .
La fusión de proteínas con MBP generalmente mejora su solubilidad y facilita su plegamiento adecuado, de modo que las proteínas de fusión suelen ser bifuncionales. [24] [30] Además, estas fusiones pueden facilitar la cristalización de proteínas difíciles, por ejemplo, proteínas de membrana. La proteína cristalizada a menudo puede tener sus estructuras resueltas por cristalografía de rayos X usando reemplazo molecular en una estructura conocida de MBP. [31]
Ver también
- Etiqueta de proteína
- Biosensores fluorescentes de glucosa
- Glutatión S-transferasa
Referencias
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enlaces externos
- Fusión N-terminal de la proteína objetivo a la proteína de unión a maltosa en la Universidad Tecnológica de Michigan
- unión a maltosa + proteína en los encabezados de temas médicos (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU .
- Protocolo genérico para la expresión y purificación de proteínas recombinantes en Escherichia coli utilizando una etiqueta combinatoria de fusión de proteína de unión His6-maltosa