Una columna de HPLC monolítica , o columna monolítica, es una columna que se utiliza en cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La estructura interna de la columna monolítica se crea de tal manera que se forman muchos canales dentro de la columna. El material dentro de la columna que separa los canales puede ser poroso y funcionalizado. Por el contrario, la mayoría de las configuraciones de HPLC utilizan columnas empaquetadas de partículas; en estas configuraciones, en el interior de la columna se utilizan microesferas de una sustancia inerte, normalmente una sílice modificada . [1]Las columnas monolíticas se pueden dividir en dos categorías, monolitos a base de sílice y a base de polímeros. Los monolitos a base de sílice son conocidos por su eficiencia en la separación de moléculas más pequeñas, mientras que los basados en polímeros son conocidos por separar moléculas de proteínas grandes.
Resumen de tecnología
En la cromatografía analítica, el objetivo es separar e identificar de forma única cada uno de los compuestos de una sustancia. Alternativamente, la cromatografía a escala preparativa es un método de purificación de grandes lotes de material en un entorno de producción. Los métodos básicos de separación en HPLC se basan en el paso de una fase móvil (agua, disolventes orgánicos , etc.) a través de una fase estacionaria (empaquetaduras de sílice particulada, monolitos, etc.) en un entorno cerrado (columna); las diferencias de reactividad entre el disolvente de interés y las fases móvil y estacionaria distinguen a los compuestos entre sí en una serie de fenómenos de adsorción y desorción. A continuación, los resultados se muestran visualmente en un cromatograma resultante . Las fases estacionarias están disponibles en muchas variedades de estilos de empaque, así como en estructuras químicas, y se pueden funcionalizar para mayor especificidad. Las columnas de estilo monolítico, o monolitos, son uno de los muchos tipos de estructura de fase estacionaria.
Los monolitos, en términos cromatográficos, son estructuras de varillas porosas caracterizadas por mesoporos y macroporos. Estos poros proporcionan monolitos con alta permeabilidad, una gran cantidad de canales y una gran superficie disponible para reactividad. La columna vertebral de una columna monolítica está compuesta por un sustrato orgánico o inorgánico y puede modificarse químicamente fácilmente para aplicaciones específicas. Su estructura única les confiere varias propiedades físico-mecánicas que les permiten desempeñarse de manera competitiva frente a las columnas empaquetadas tradicionalmente.
Históricamente, la columna HPLC típica consiste en sílice en partículas de alta pureza comprimida en tubos de acero inoxidable. Para reducir los tiempos de ejecución y aumentar la selectividad, se han perseguido distancias de difusión más pequeñas. Para lograr distancias de difusión más pequeñas, ha habido una disminución en el tamaño de las partículas. Sin embargo, a medida que disminuye el tamaño de las partículas, la contrapresión (para un diámetro de columna dado y un flujo volumétrico dado) aumenta proporcionalmente. La presión es inversamente proporcional al cuadrado del tamaño de partícula; es decir, cuando el tamaño de partícula se reduce a la mitad, la presión aumenta en un factor de cuatro. Esto se debe a que a medida que los tamaños de las partículas se hacen más pequeños, los vacíos intersticiales (los espacios entre las partículas) también lo hacen y es más difícil empujar los compuestos a través de los espacios más pequeños. Los sistemas de HPLC modernos están generalmente diseñados para soportar alrededor de 18,000 libras por pulgada cuadrada (1,200 bar) de contrapresión con el fin de lidiar con este problema.
Los monolitos también tienen distancias de difusión muy cortas , mientras que también proporcionan múltiples vías para la dispersión de solutos. Las columnas de partículas empaquetadas tienen valores de conectividad de poros de aproximadamente 1,5, mientras que los monolitos tienen valores que van de 6 a más de 10. Esto significa que, en una columna de partículas, un analito dado puede difundirse dentro y fuera del mismo poro, o entrar a través de un poro. y salir a través de un poro conectado. Por el contrario, un analito en un monolito puede ingresar a un canal y salir a través de cualquiera de 6 o más lugares diferentes. [2] Una pequeña parte de la superficie de un monolito es inaccesible para los compuestos en la fase móvil. El alto grado de interconectividad en los monolitos confiere una ventaja que se ve en las bajas contrapresiones y los altos caudales fácilmente alcanzables.
Los monolitos son ideales para moléculas grandes . Como se mencionó anteriormente, los tamaños de partículas están disminuyendo en un intento por lograr una resolución más alta y separaciones más rápidas, lo que condujo a contrapresiones más altas. Cuando se utilizan tamaños de partículas más pequeños para separar biomoléculas , las contrapresiones aumentan aún más debido al gran tamaño de la molécula. En los monolitos, donde las contrapresiones son bajas y los tamaños de los canales son grandes, las separaciones de moléculas pequeñas son menos eficientes. Esto se demuestra por las capacidades de unión dinámica, una medida de cuánta muestra puede unirse a la superficie de la fase estacionaria. La capacidad de unión dinámica de los monolitos para moléculas grandes puede ser diez veces mayor que la de los empaques de partículas. [2]
Los monolitos no exhiben fuerzas de corte ni efectos de remolinos. La alta interconectividad de los mesoporos permite múltiples avenidas de flujo convectivo a través de la columna. El transporte de masa de solutos a través de la columna no se ve afectado relativamente por la velocidad de flujo. Esto está completamente en desacuerdo con los empaques de partículas tradicionales, por lo que los efectos de remolino y las fuerzas de cizallamiento contribuyen en gran medida a la pérdida de resolución y capacidad, como se ve en la curva de vanDeemter. Sin embargo, los monolitos pueden sufrir una desventaja de flujo diferente: efectos de pared. Los monolitos de sílice, especialmente, tienen una tendencia a separarse de los lados del revestimiento de la columna. Cuando esto sucede, el flujo de la fase móvil ocurre alrededor de la fase estacionaria así como a través de ella, disminuyendo la resolución. Los efectos de las paredes se han reducido considerablemente gracias a los avances en la construcción de columnas.
Otras ventajas de los monolitos conferidas por su construcción individual incluyen una mayor reproducibilidad columna a columna y lote a lote. Una técnica para crear columnas monolíticas es polimerizar la estructura in situ . Esto implica llenar el molde o el tubo de la columna con una mezcla de monómeros , un agente de reticulación, un iniciador de radicales libres y un disolvente porogénico, y luego iniciar el proceso de polimerización en condiciones térmicas o de irradiación cuidadosamente controladas. La polimerización monolítica in situ evita la fuente principal de variabilidad de columna a columna, que es el procedimiento de empaque. [3]
Además, las columnas de partículas empaquetadas deben mantenerse en un ambiente solvente y no pueden exponerse al aire durante o después del procedimiento de empacado. Si se exponen al aire, los poros se secan y ya no proporcionan una superficie adecuada para la reactividad; la columna debe reembalarse o desecharse. Además, debido a que la compresión de partículas y la uniformidad de empaquetamiento no son relevantes para los monolitos, exhiben una mayor robustez mecánica; si las columnas de partículas se caen, por ejemplo, la integridad de la columna puede resultar dañada. Las columnas monolíticas son más estables físicamente que sus contrapartes de partículas.
Desarrollo tecnológico
Las raíces de la cromatografía líquida se remontan a hace más de un siglo, hasta 1900, cuando el botánico ruso Mikhail Tsvet comenzó a experimentar con pigmentos vegetales en clorofila . [4] [ referencia circular ] Observó que, cuando se aplicaba un disolvente, aparecían distintas bandas que migraban a diferentes velocidades a lo largo de una fase estacionaria. Para esta nueva observación, acuñó el término "cromatografía", una imagen en color. Su primera conferencia sobre el tema se presentó en 1903, pero su aporte más importante se dio tres años después, en 1906, cuando se publicó el artículo “ Análisis de adsorción y método cromatográfico. Aplicaciones sobre la química de la clorofila ”, se publicó. La rivalidad con un colega que denunció pronta y abiertamente su trabajo significó que el análisis cromatográfico fue archivado durante casi 25 años. La gran ironía del asunto es que fueron los alumnos de su rival quienes luego retomaron el estandarte de la cromatografía en su trabajo con carotinas.
En gran medida sin cambios desde la época de Tswett hasta la década de 1940, la cromatografía de fase normal se realizó pasando un disolvente alimentado por gravedad a través de pequeños tubos de vidrio llenos de perlas adsorbentes peliculares. [ cita requerida ] Sin embargo, fue en la década de 1940 que hubo una gran revolución en la cromatografía de gases (GC). Aunque la GC fue una técnica maravillosa para analizar compuestos inorgánicos , menos del 20% de las moléculas orgánicas se pueden separar utilizando esta técnica. Fue Richard Synge , quien en 1952 ganó el Premio Nobel de Química por su trabajo con la cromatografía de partición , quien aplicó los conocimientos teóricos adquiridos en su trabajo en GC a LC. A partir de esta revolución, la década de 1950 también vio el advenimiento de la cromatografía en papel, la cromatografía de partición en fase inversa (RPC) y la cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). Los primeros geles para su uso en LC se crearon utilizando dextranos reticulados ( Sephadex ) en un intento de realizar la predicción de Synge de que una fase estacionaria única de una sola pieza podría proporcionar una solución cromatográfica ideal.
En la década de 1960, se crearon geles de poliacrilamida y agarosa en un intento adicional de crear una fase estacionaria de una sola pieza, pero la pureza y la estabilidad de los componentes disponibles no resultaron útiles para la implementación en la HPLC. En esta década, se inventó la cromatografía de afinidad, se utilizó por primera vez un detector ultravioleta ( UV ) junto con LC y, lo más importante, nació la HPLC moderna. Csaba Horvath lideró el desarrollo de la HPLC moderna uniendo equipos de laboratorio para satisfacer sus propósitos. En 1968, Picker Nuclear Company comercializó la primera HPLC disponible comercialmente como un "analizador de ácido nucleico". Al año siguiente, se llevó a cabo el primer simposio internacional sobre HPLC, y Kirkland en DuPont pudo funcionalizar partículas peliculares de porosidad controlada por primera vez.
Las décadas de 1970 y 1980 fueron testigos de un renovado interés en los medios de separación con volúmenes reducidos de vacíos interparticulares. [ cita requerida ] La cromatografía de perfusión mostró, por primera vez, que los medios de cromatografía podían soportar altas velocidades de flujo sin sacrificar la resolución. [5] Los monolitos encajan perfectamente en esta nueva clase de medios, ya que no exhiben un volumen vacío y pueden soportar caudales de hasta 9 ml / minuto. Los monolitos poliméricos tal como existen en la actualidad fueron desarrollados de forma independiente por tres laboratorios diferentes a fines de la década de 1980 dirigidos por Hjerten, Svec y Tennikova. Simultáneamente, las bioseparaciones se volvieron cada vez más importantes y las tecnologías monolíticas demostraron ser beneficiosas en las separaciones biotecnológicas.
Aunque el enfoque de la industria en la década de 1980 se centró en la biotecnología, en la década de 1990 el enfoque se desplazó hacia la ingeniería de procesos. [ cita requerida ] Mientras que los cromatógrafos convencionales usaban columnas de partículas de 3 μm, las columnas de menos de 2 μm estaban en fase de investigación. Las partículas más pequeñas significaron una mejor resolución y tiempos de ejecución más cortos; también hubo un aumento asociado en la contrapresión. Para resistir la presión, surgió un nuevo campo de la cromatografía: UHPLC o UPLC, cromatografía líquida de ultra alta presión. Los nuevos instrumentos pudieron soportar presiones de hasta 15.000 libras por pulgada cuadrada (1.000 bar), a diferencia de las máquinas convencionales, que, como se indicó anteriormente, pueden soportar hasta 5.000 libras por pulgada cuadrada (340 bar). UPLC es una solución alternativa a los mismos problemas que resuelven las columnas monolíticas. De manera similar a la UPLC, la cromatografía monolítica puede ayudar al resultado final al aumentar el rendimiento de la muestra, pero sin la necesidad de gastar capital en nuevos equipos.
En 1996, Nobuo Tanaka , en el Instituto de Tecnología de Kyoto , preparó monolitos de sílice utilizando una síntesis de suspensión coloidal (también conocida como " sol-gel ") desarrollada por un colega. [ cita requerida ] El proceso es diferente al que se usa en los monolitos poliméricos. Los monolitos poliméricos, como se mencionó anteriormente, se crean in situ, usando una mezcla de monómeros y un porógeno dentro del tubo de la columna. Los monolitos de sílice, por otro lado, se crean en un molde, experimentan una cantidad significativa de contracción y luego se recubren con un tubo retráctil polimérico como PEEK (polieteretercetona) para reducir los efectos de la pared. Este método limita el tamaño de las columnas que se pueden producir a menos de 15 cm de largo, y aunque los diámetros internos analíticos estándar se logran fácilmente, actualmente existe una tendencia en el desarrollo de monolitos de sílice capilares a nanoescala y a escala de preparación.
Ciclo de vida de la tecnología
Los monolitos de sílice solo han estado disponibles comercialmente desde 2001, cuando Merck comenzó su campaña Chromolith. [6] La tecnología Chromolith fue licenciada por el grupo de Soga y Nakanishi en la Universidad de Kioto. El nuevo producto ganó el premio PittCon Editors 'Gold Award por Mejor Producto Nuevo, así como un premio R&D 100 , ambos en 2001.
Las columnas monolíticas individuales tienen un ciclo de vida que generalmente excede el de sus competidores de partículas. Al seleccionar un proveedor de columnas de HPLC, la vida útil de la columna fue superada solo por la reproducibilidad de columna a columna en importancia para el comprador. Las columnas de cromolito, por ejemplo, han demostrado la reproducibilidad de 3300 inyecciones de muestras y 50 000 volúmenes de columna de fase móvil. También es importante para el ciclo de vida del monolito su mayor robustez mecánica; Los monolitos poliméricos pueden soportar rangos de pH de 1 a 14, pueden soportar temperaturas elevadas y no necesitan manipularse con delicadeza. “Los monolitos todavía son adolescentes”, afirma Frantisec Svec, líder en el campo de las fases estacionarias novedosas para LC. [7]
Evolución de la industria
La cromatografía líquida tal como la conocemos hoy en día comenzó realmente en 1969, cuando se diseñó y comercializó la primera HPLC moderna como analizador de ácidos nucleicos . [8] Las columnas a lo largo de la década de 1970 no eran confiables, los caudales de las bombas eran inconsistentes y muchos compuestos biológicamente activos escapaban a la detección por los detectores de fluorescencia y UV . El enfoque en los métodos de purificación en la década de 1970 se transformó en análisis más rápidos en la década de 1980, cuando los controles computarizados se integraron en el equipo de HPLC. Los grados más altos de informatización llevaron a que en la década de 1990 se hiciera hincapié en equipos automatizados más precisos, más rápidos. Atípico de muchas tecnologías de los años 60 y 70, el énfasis en las mejoras no estaba en “más grande y mejor”, sino en “más pequeño y mejor”. Al mismo tiempo que mejoraba la interfaz de usuario de HPLC, era fundamental poder aislar cientos de péptidos o biomarcadores de tamaños de muestra cada vez menores.
La instrumentación analítica de laboratorio solo ha sido reconocida como una industria separada y distinta por NAICS y SIC desde 1987. [ cita requerida ] Esta segmentación de mercado incluye no solo cromatografía de gases y líquidos, sino también espectrometría de masas e instrumentos espectrofotométricos. Desde que se reconoció por primera vez como un mercado separado, las ventas de equipos de laboratorio analítico aumentaron de aproximadamente $ 3.5 mil millones en 1987 a más de $ 26 mil millones en 2004. [9] Se espera que los ingresos en el mercado mundial de cromatografía líquida, específicamente, crezcan de $ 3.4 mil millones en 2007 a $ 4.7 mil millones en 2013, con una ligera disminución en el gasto esperado en 2008 y 2009 debido a la recesión económica mundial y la disminución o estancamiento del gasto. La industria farmacéutica por sí sola representa el 35% de todos los instrumentos de HPLC en uso. [10] La principal fuente de crecimiento de la LC proviene de las empresas farmacéuticas y de las biociencias .
Aplicaciones tecnológicas
En su forma más temprana, un botánico ruso utilizó la cromatografía líquida para separar los pigmentos de la clorofila. Décadas más tarde, otros químicos utilizaron el procedimiento para el estudio de las carotinas. La cromatografía líquida se utilizó luego para el aislamiento de moléculas pequeñas y compuestos orgánicos como los aminoácidos , y más recientemente se ha utilizado en la investigación de péptidos y ADN . Las columnas monolíticas han sido fundamentales para avanzar en el campo de la investigación biomolecular.
En ferias comerciales recientes y reuniones internacionales de HPLC, el interés en los monolitos de columna y las aplicaciones biomoleculares ha crecido de manera constante, y esta correlación no es una coincidencia. Se ha demostrado que los monolitos poseen un gran potencial en los campos “ómicos”: genómica , proteómica , metabolómica y farmacogenómica , entre otros. El enfoque reduccionista para comprender las vías químicas del cuerpo y las reacciones a diferentes estímulos, como las drogas, son esenciales para las nuevas olas de atención médica como la medicina personalizada .
La farmacogenómica estudia cómo las respuestas a los productos farmacéuticos difieren en eficacia y toxicidad según las variaciones en el genoma del paciente; es una correlación de la respuesta al fármaco con la expresión génica en un paciente. Jeremy K. Nicholson del Imperial College , Londres , utiliza un punto de vista postgenomic para entender las reacciones adversas a los medicamentos y las bases moleculares de Disesase humano. [11] Su grupo estudió los perfiles metabólicos microbianos intestinales y pudo ver distintas diferencias en las reacciones a la toxicidad y el metabolismo de los fármacos, incluso entre varias distribuciones geográficas de la misma raza. La cromatografía de monolito de afinidad proporciona otro enfoque para las mediciones de respuesta al fármaco. David Hage, de la Universidad de Nebraska, une ligandos a soportes monolíticos y mide los fenómenos de equilibrio de las interacciones de unión entre fármacos y proteínas séricas . [7] Actualmente se utiliza un enfoque basado en monolitos en la Universidad de Bolonia , Italia , para el cribado de alta velocidad de candidatos a fármacos en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer . [5] En 2003, Regnier y Liu de la Universidad de Purdue describieron un procedimiento de LC multidimensional para identificar polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en proteínas . [12] Los SNP son alteraciones en el código genético que a veces pueden causar cambios en la conformación de las proteínas , como es el caso de la anemia de células falciformes . Los monolitos son particularmente útiles en este tipo de separaciones debido a sus capacidades superiores de transporte de masa , contrapresiones bajas junto con caudales más rápidos y relativa facilidad de modificación de la superficie de apoyo.
Las bioseparaciones a escala de producción también se mejoran mediante tecnologías de columnas monolíticas. Las rápidas separaciones y el alto poder de resolución de los monolitos para moléculas grandes hacen posible el análisis en tiempo real de los fermentadores de producción. La fermentación es bien conocida por su uso en la elaboración de bebidas alcohólicas , pero también es un paso esencial en la producción de vacunas contra la rabia y otros virus . El análisis en línea en tiempo real es fundamental para el seguimiento de las condiciones de producción, y se pueden realizar ajustes si es necesario. Boehringer Ingelheim Austria ha validado un método con cGMP (buenas prácticas comerciales de fabricación) para la producción de plásmidos de ADN de calidad farmacéutica . Pueden procesar 200 litros de caldo de fermentación en un monolito de 800 ml. [5] En BIA Separations , el tiempo de procesamiento del virus del mosaico del tomate disminuyó considerablemente de los cinco días estándar de trabajo manual intensivo a una pureza equivalente y una mejor recuperación en solo dos horas con una columna monolítica. [5] También se han purificado otros virus en monolitos.
Otra área de interés para HPLC es la ciencia forense . La GC-MS (cromatografía de gases y espectroscopía de masas) se considera generalmente el estándar de oro para el análisis forense. Se utiliza junto con bases de datos en línea para el análisis rápido de compuestos en pruebas de alcohol en sangre , causa de muerte, drogas ilícitas y análisis de alimentos, especialmente en casos de intoxicación. [12] El análisis de la buprenorfina , un sustituto de la heroína , demostró la utilidad potencial de la CL multidimensional como método de detección de bajo nivel. Los métodos de HPLC pueden medir este compuesto a 40 ng / mL , en comparación con GC-MS a 0.5 ng / mL, pero LC-MS-MS puede detectar buprenorfina a niveles tan bajos como 0.02 ng / mL. La sensibilidad de la CL multidimensional es, por tanto, 2000 veces mayor que la de la HPLC convencional.
Aplicaciones de la industria
El mercado de la cromatografía líquida es increíblemente diverso. De cinco a diez empresas son constantemente líderes del mercado, sin embargo, casi la mitad del mercado está formado por empresas pequeñas y fragmentadas. Esta sección del informe se centrará en los roles que algunas empresas han tenido en llevar tecnologías de columnas monolíticas al mercado comercial.
En 1998, nació la empresa de biotecnología BIA Separations of Ljubljana , Eslovenia . La tecnología fue desarrollada originalmente por Tatiana Tennikova y Frantisek Svec durante una colaboración entre sus respectivos institutos. La patente de estas columnas fue adquirida por BIA Separations y Ales Podgornik y Milos Barut desarrollaron la primera columna monolítica disponible comercialmente en forma de disco corto encapsulado en una carcasa de plástico. Desde entonces, la marca registrada CIM, BIA Separations, ha introducido líneas completas de monolitos poliméricos de afinidad, de intercambio iónico, fase reversa y fase normal. Ales Podgornik y Janez Jancar luego desarrollaron columnas monolíticas de tubos a gran escala para uso industrial. La columna más grande disponible actualmente es 8L. En mayo de 2008, la potencia de instrumentación LC Agilent Technologies acordó comercializar las columnas analíticas de BIA Separations basadas en tecnología monolítica. Agilent's comercializó las columnas con fases de intercambio iónico fuertes y débiles y Proteína A en septiembre de 2008 cuando presentaron su nueva línea de productos Bio-Monolith en la conferencia BioProcess International.
Si bien BIA Separations fue la primera en comercializar monolitos poliméricos, Merck KGaA fue la primera empresa en comercializar monolitos de sílice. En 1996, Tanaka y sus colaboradores del Instituto de Tecnología de Kyoto publicaron un extenso trabajo sobre tecnologías de monolitos de sílice. Más tarde, Merck recibió una licencia del Instituto de Tecnología de Kyoto para desarrollar y producir los monolitos de sílice. Poco después, en 2001, Merck presentó su línea Chromolith de columnas HPLC monolíticas en la feria comercial de instrumentación analítica PittCon. Inicialmente, dice Karin Cabrera, científica senior de Merck, la alta tasa de flujo fue el punto de venta de la línea Chromolith. Sin embargo, basándose en los comentarios de los clientes, Merck pronto se enteró de que las columnas eran más estables y de mayor duración que las columnas llenas de partículas. [7] Las columnas fueron los destinatarios de varios premios de productos nuevos. Las dificultades en la producción de los monolitos de sílice y la estricta protección de las patentes han impedido los intentos de otras empresas de desarrollar un producto similar. Se ha observado que existen más patentes sobre cómo encapsular la varilla de sílice que sobre la fabricación de la propia sílice.
Históricamente, Merck ha sido conocida por sus productos químicos superiores y, en cromatografía líquida, por la pureza y confiabilidad de su sílice en partículas. Merck no es conocido por sus columnas LC. Cinco años después de la introducción de su línea Chromolith, Merck tomó una decisión de marketing muy estratégica. Otorgaron una sublicencia mundial de la tecnología a una pequeña empresa innovadora (menos de $ 100 millones en ventas) bien conocida por su tecnología de columna de vanguardia: Phenomenex. Este fue un movimiento estratégico superior por dos razones. Como se mencionó anteriormente, Merck no es muy conocido por su fabricación de columnas. Además, tener más de un fabricante de monolitos de sílice sirve para validar mejor la tecnología. Habiendo sublicenciado la tecnología de Merck, Phenomenex presentó su línea de productos Onyx en enero de 2005.
En el otro lado de las tecnologías monolíticas están los polímeros. A diferencia de las columnas de sílice inorgánica, los monolitos de polímero están hechos de una base de polímero orgánico. Dionex , tradicionalmente conocido por sus capacidades de cromatografía iónica, ha liderado este lado del campo. En la década de 1990, Dionex adquirió por primera vez una licencia para la tecnología de monolitos poliméricos desarrollada por el investigador líder en cromatografía monolítica Frantisec Svec mientras estaba en la Universidad de Cornell . En 2000, adquirieron LC Packings, cuyas competencias estaban en los empaques de columna LC. LC Packings / Dionex reveló su primera columna capilar monolítica en la Conferencia LC-MS de Montreux. A principios de ese año, otra empresa, Isco, introdujo una columna monolítica de poliestireno divinilbenceno (PS-DVB) con la marca SWIFT. En enero de 2005, se vendieron a Dionex los derechos de los productos de medios SWIFT, la propiedad intelectual, la tecnología y los activos relacionados de Teledyne Isco. Aunque las competencias centrales de Dionex han estado tradicionalmente en la cromatografía iónica, a través de adquisiciones estratégicas y transferencias de tecnología, se ha establecido rápidamente como el principal productor de monolitos poliméricos.
Impacto económico
Aunque los numerosos avances de la HPLC y los monolitos son muy visibles dentro de los límites de las industrias analítica y farmacéutica, es poco probable que la sociedad en general esté al tanto de estos desarrollos. Actualmente, los consumidores pueden presenciar desarrollos tecnológicos en la industria de las ciencias analíticas en forma de una gama más amplia de productos farmacéuticos disponibles de mayor pureza, pruebas forenses avanzadas en juicios penales, mejor monitoreo ambiental y retornos más rápidos de pruebas médicas . En el futuro, presumiblemente, este puede no ser el caso. A medida que la medicina se vuelve más individualizada con el tiempo, parece más probable que los consumidores tomen conciencia de que algo está mejorando la calidad de su atención. Sin embargo, es poco probable que la idea adicional de que están involucrados monolitos o HPLC preocupe al público en general.
Hay dos factores principales de costos detrás del cambio tecnológico en esta industria. Aunque muchas áreas analíticas diferentes utilizan LC, incluidas las industrias de alimentos y bebidas, laboratorios forenses e instalaciones de pruebas clínicas, el mayor impulso hacia los desarrollos tecnológicos proviene de las ramas de investigación y desarrollo y producción de la industria farmacéutica. Las áreas en las que las tecnologías de columnas monolíticas de alto rendimiento probablemente tengan el mayor impacto económico son la I + D y el procesamiento posterior.
Desde el campo de la investigación y el desarrollo surge el deseo de lograr separaciones más rápidas y resueltas de cantidades de muestra más pequeñas. La única fase del desarrollo de fármacos bajo el control directo de una empresa farmacéutica es la fase de I + D. El objetivo del trabajo analítico es obtener la mayor cantidad de información posible de la muestra. En esta etapa, el alto rendimiento y el análisis de pequeñas cantidades de muestras son fundamentales. Las empresas farmacéuticas están buscando herramientas que les permitan medir y predecir mejor la eficacia de los fármacos candidatos en tiempos más cortos y con ensayos clínicos menos costosos. [11] Con este fin, las separaciones a nanoescala, los equipos de HPLC altamente automatizados y la cromatografía multidimensional se han vuelto influyentes.
El método predominante para aumentar la sensibilidad de los métodos analíticos ha sido la cromatografía multidimensional. Esta práctica utiliza otras técnicas de análisis junto con la cromatografía líquida. Por ejemplo, la espectrometría de masas (MS) ha ganado mucha popularidad como técnica analítica en línea después de la HPLC. Sin embargo, está limitado porque la EM, como la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) o las técnicas de ionización por electropulverización (ESI), solo es factible cuando se utilizan cantidades muy pequeñas de soluto y disolvente; LC-MS se usa con técnicas de escala nano o capilar, pero no se puede usar en escala de preparación. Otra táctica para aumentar la selectividad en la cromatografía multidimensional es utilizar dos columnas con diferente selectividad ortogonalmente; es decir ... enlazar una columna de intercambio iónico a una columna C18 con tapón terminal. En 2007, Karger informó que, a través de la cromatografía multidimensional y otras técnicas, comenzando con solo unas 12.000 células que contenían entre 1 y 4 μg de proteína, pudo identificar 1867 proteínas únicas. De ellos, Karger puede aislar 4 que pueden ser de interés como marcadores de cáncer de cuello uterino. [11] Hoy en día, cromatógrafos líquidos utilizando LC multidimensional puede aislar compuestos en el femtomol (10 -15 moles) y attomol (10 -18 niveles moles).
Después de que un medicamento ha sido aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA), el énfasis en una compañía farmacéutica está en llevar el producto al mercado. Aquí es donde la cromatografía a escala de preparación o de proceso tiene un papel. A diferencia del análisis analítico, la cromatografía a escala preparatoria se centra en el aislamiento y la pureza de los compuestos. Existe una compensación entre el grado de pureza del compuesto y la cantidad de tiempo necesaria para lograr esa pureza. Desafortunadamente, muchas de las soluciones preparatorias o de escala de proceso utilizadas por las compañías farmacéuticas son propietarias, debido a las dificultades para patentar un proceso. Por lo tanto, no hay mucha literatura disponible. Sin embargo, algunos intentos de abordar los problemas de la cromatografía a escala de preparación incluyen monolitos y lechos móviles simulados .
Una comparación de la captura de proteínas de inmunoglobulina en una columna convencional y una columna monolítica produce algunos resultados económicamente interesantes. [2] Si los tiempos de procesamiento son equivalentes, los volúmenes de procesamiento de IgG , un anticuerpo , son 3120 l para columnas convencionales frente a 5538 l para columnas monolíticas. Esto representa un aumento del 78% en la eficiencia del volumen del proceso, mientras que al mismo tiempo solo se genera una décima parte del volumen de residuos de medios. La columna monolito no solo es más prudente económicamente al considerar el valor de los tiempos de procesamiento del producto, sino que, al mismo tiempo, se utiliza menos medio, lo que representa una reducción significativa en los costos variables.
Referencias
- ^ Miller, James (2005). Cromatografía (Segunda ed.). Hoboken, Nueva Jersey: John Wiley & Sons. pag. 212. ISBN 978-0471472070.
- ^ a b c "Eliminación del cuello de botella del procesamiento posterior con monolitos y cromatografía de lecho móvil simulado". Pete Gagnon, BioProcess International, septiembre de 2008.
- ^ "Monolitos porosos: la última generación de fases estacionarias para HPLC y métodos relacionados". Desarrollos recientes en la tecnología de columnas LC, junio de 2003, 24-28.
- ^ Historia de la cromatografía
- ^ a b c d "Se considera que los monolitos revitalizan las bioseparaciones: nuevas investigaciones ampliarán la gama de aplicaciones". Noticias de ingeniería genética y biotecnología, octubre de 2006 (volumen 26, núm. 17).
- ^ "SilicaRODTM Un nuevo desafío en separaciones rápidas por cromatografía líquida de alto rendimiento". Tendencias en química analítica, vol. 17, 1998, 50-53.
- ^ a b c "Cromatografía monolítica: los materiales de columna no tradicionales mejoran las separaciones de biomezclas". Archivado el 29 de agosto de 2008 en Wayback Machine Chemical & Engineering News, diciembre de 2006, 84 (50), 14-19.
- ^ Ettre, Leslie. "Csaba Horváth y el desarrollo del primer cromatógrafo líquido moderno de alto rendimiento" . chromatographyonline.com . LC-GC Norteamérica . Consultado el 1 de mayo de 2005 .
- ^ "Instrumentos analíticos de laboratorio: instantánea de la industria". www.galenet.galegroup.com, febrero de 2009.
- ^ "El mercado de HPLC en todo el mundo tiene un valor de más de 2.500 millones de dólares" . www.laboratoryequipmentworld.com. Archivado desde el original el 4 de febrero de 2009 . Consultado el 14 de mayo de 2009 .
- ^ a b c "Aspectos destacados de la tecnología y la aplicación de HPLC 2007". Archivado el 11 de julio de 2011 en la Wayback Machine LCGC North America, 25 (10), 1000–1012.
- ^ a b "Aspectos destacados de HPLC 2003". Archivado el 11 de julio de 2011 en Wayback Machine LCGC North America, 21 (9), 872-887.
enlaces externos
- "Historia de HPLC". https://web.archive.org/web/20100410045845/http://kerouac.pharm.uky.edu/ .