Escritura de secuencia multilocus

Técnica en biología molecular

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La tipificación de secuencias multilocus ( MLST ) es una técnica en biología molecular para la tipificación de múltiples loci . El procedimiento caracteriza aislamientos de especies microbianas utilizando las secuencias de ADN de fragmentos internos de múltiples genes domésticos . Se utilizan aproximadamente 450-500 pb fragmentos internos de cada gen, ya que estos se pueden secuenciar con precisión en ambas cadenas utilizando un secuenciador de ADN automatizado. Para cada gen de mantenimiento, las diferentes secuencias presentes dentro de una especie bacteriana se asignan como alelos distintos y, para cada aislado, los alelos en cada uno de los loci definen el perfil alélico o el tipo de secuencia (ST).

El primer esquema MLST que se desarrolló fue para Neisseria meningitidis , ^[1] el agente causante de la meningitis meningocócica y la septicemia . Desde su introducción para la investigación de la historia evolutiva, MLST se ha utilizado no solo para patógenos humanos sino también para patógenos de plantas. ^[2]

Principio

MLST mide directamente las variaciones de la secuencia de ADN en un conjunto de genes de mantenimiento y caracteriza las cepas por sus perfiles alélicos únicos. El principio de MLST es simple: la técnica implica amplificación por PCR seguida de secuenciación de ADN . Las diferencias de nucleótidos entre cepas pueden comprobarse en un número variable de genes dependiendo del grado de discriminación deseado.

El flujo de trabajo de MLST implica: 1) recopilación de datos, 2) análisis de datos y 3) análisis de secuencia de múltiples enfoques. En el paso de recopilación de datos, la identificación definitiva de la variación se obtiene mediante la determinación de la secuencia de nucleótidos de los fragmentos de genes. En el paso de análisis de datos, a todas las secuencias únicas se les asignan números de alelos y se combinan en un perfil alélico y se les asigna un tipo de secuencia (ST). Si se encuentran nuevos alelos y ST, se almacenan en la base de datos después de la verificación. En el último paso de análisis de MLST, la relación de los aislamientos se realiza comparando perfiles alélicos. Los investigadores realizan estudios epidemiológicos y filogenéticos comparando ST de diferentes complejos clonales. Se produce un gran conjunto de datos durante el proceso de secuenciación e identificación, por lo que se utilizan técnicas bioinformáticas para organizar, gestionar,analizar y fusionar todos los datos biológicos.

Para lograr el equilibrio entre el poder de identificación aceptable, el tiempo y el costo de la tipificación de la cepa, en los laboratorios se utilizan comúnmente entre siete y ocho genes domésticos. Citando a Staphylococcus aureus como ejemplo, se utilizan siete genes domésticos en la tipificación MLST. Estos genes incluyen carbamato quinasa ( arcC ), shikimato deshidrogenasa ( aroE ), glicerol quinasa ( glpF ), guanilato quinasa ( gmk ), fosfato acetiltransferasa ( pta ), triosafosfato isomerasa ( tpi ) y acetil coenzima A acetiltransferasa ( especificada por ytiltransferasa ). Sitio web de MLST. Sin embargo, no es raro que se utilicen hasta diez genes domésticos. ParaVibrio vulnificus , los genes de mantenimiento utilizados son glucosa-6-fosfato isomerasa ( glp ), ADN girasa, subunidad B ( gyrB ), malato-lactato deshidrogenasa ( mdh ), metionil-tRNA sintetasa ( metG ), fosforribosilaminoimidazol sintetasa ( purM ), treonina deshidrogenasa ( dtdS ), diaminopimelato descarboxilasa ( lysA ), subunidad alfa transhidrogenasa ( pntA ), dihidroorotasa ( pyrC ) y triptofanasa ( tnaA ). Por tanto, tanto el número como el tipo de genes de mantenimiento interrogados por MLST pueden diferir de una especie a otra.

Para cada uno de estos genes de mantenimiento, las diferentes secuencias se asignan como alelos y los alelos en los loci proporcionan un perfil alélico. Entonces, una serie de perfiles puede ser el marcador de identificación para la tipificación de cepas. Las secuencias que difieren incluso en un solo nucleótido se asignan como alelos diferentes y no se da ninguna ponderación para tener en cuenta el número de diferencias de nucleótidos entre los alelos, ya que no podemos distinguir si las diferencias en múltiples sitios de nucleótidos son el resultado de múltiples mutaciones puntuales o de una sola. intercambio recombinacional. El gran número de alelos potenciales en cada uno de los loci proporciona la capacidad de distinguir miles de millones de perfiles alélicos diferentes, y solo se esperaría que una cepa con el alelo más común en cada locus ocurriera por casualidad aproximadamente una vez en 10,000 aislamientos. ^{[[cita requerida ]}A pesar de que MLST proporciona un alto poder discriminatorio, la acumulación de cambios de nucleótidos en los genes de mantenimiento es un proceso relativamente lento y el perfil alélico de unaisladobacteriano es lo suficientemente estable en el tiempo para que el método sea ideal para la epidemiología global.

La relación de los aislamientos se muestra como un dendrograma construido utilizando la matriz de diferencias por pares entre sus perfiles alélicos , eBURST o un árbol de expansión mínimo (MST). El dendrograma es sólo una forma conveniente de mostrar aquellos aislados que tienen perfiles alélicos idénticos o muy similares que se puede suponer que se derivan de un ancestro común; las relaciones entre aislamientos que difieren en más de tres de los siete loci probablemente no sean confiables y no deben tomarse para inferir su filogenia. ^{[3] [4]} El MST conecta todas las muestras de tal manera que la distancia sumada de todas las ramas del árbol es mínima. ^[5]

Alternativamente, la relación de los aislamientos también se puede analizar con Análisis de secuencia de MultiLocus ( MLSA ). Esto no usa los alelos asignados, sino que concatena las secuencias de los fragmentos de genes de los genes internos y usa esta secuencia concatenada para determinar las relaciones filogenéticas. En contraste con MLST, este análisis asigna una mayor similitud entre secuencias que difieren sólo en un único nucleótido y una menor similitud entre secuencias con múltiples diferencias de nucleótidos. Como resultado, este análisis es más adecuado para organismos con una evolución clonal y menos adecuado para organismos en los que los eventos recombinantes ocurren con mucha frecuencia. También se puede utilizar para determinar las relaciones filogenéticas entre especies estrechamente relacionadas. ^[6]Los términos MLST y MLSA a menudo se consideran intercambiables. Sin embargo, esto no es correcto ya que cada método de análisis tiene sus características y usos distintivos. Se debe tener cuidado de utilizar el término correcto.

Comparación con otras técnicas

Se habían establecido métodos de tipificación serológica anteriores para diferenciar los aislados bacterianos, pero la tipificación inmunológica tiene inconvenientes como la dependencia de pocos loci antigénicos y reactividades impredecibles de anticuerpos con diferentes variantes antigénicas. Se han propuesto varios esquemas de tipificación molecular para determinar la relación de patógenos, como electroforesis en gel de campo pulsado ( PFGE ), ribotipado y huellas dactilares basadas en PCR . Pero estos métodos de subtipificación basados ​​en bandas de ADN no proporcionan análisis evolutivos significativos. A pesar de que muchos investigadores consideran al PFGE como el "estándar de oro", muchas cepas no se pueden tipificar mediante esta técnica debido a la degradación del ADN durante el proceso (frotis de gel).

El enfoque de MLST es distinto de la electroforesis enzimática de múltiples locus(MLEE), que se basa en diferentes movilidades electroforéticas (EM) de múltiples enzimas metabólicas centrales. Los alelos en cada locus definen la EM de sus productos, ya que diferentes secuencias de aminoácidos entre enzimas dan como resultado diferentes movilidades y bandas distintas cuando se ejecutan en un gel. La relación de los aislados se puede visualizar con un dendrograma generado a partir de la matriz de diferencias por pares entre los tipos electroforéticos. Este método tiene una resolución más baja que MLST por varias razones, todas derivadas del hecho de que la diversidad de fenotipos enzimáticos es simplemente un proxy de la diversidad de secuencias de ADN. Primero, las enzimas pueden tener diferentes secuencias de aminoácidos sin tener EM lo suficientemente diferentes para dar bandas distintas. En segundo lugar, las "mutaciones silenciosas" pueden alterar la secuencia de ADN de un gen sin alterar los aminoácidos codificados. En tercer lugar,el fenotipo de la enzima se puede alterar fácilmente en respuesta a las condiciones ambientales y afectar gravemente la reproducibilidad de los resultados de MLEE; las modificaciones comunes de las enzimas son la fosforilación, la unión del cofactor y la escisión de las secuencias de transporte. Esto también limita la comparabilidad de los datos MLEE obtenidos por diferentes laboratorios, mientras que MLST proporciona datos de secuencia de ADN portátiles y comparables y tiene un gran potencial para la automatización y estandarización.mientras que MLST proporciona datos de secuencia de ADN portátiles y comparables y tiene un gran potencial para la automatización y estandarización.mientras que MLST proporciona datos de secuencia de ADN portátiles y comparables y tiene un gran potencial para la automatización y estandarización.

MLST no debe confundirse con los códigos de barras de ADN . Este último es un método taxonómico que utiliza marcadores genéticos cortos para reconocer especies particulares de eucariotas. Se basa en el hecho de que el ADN mitocondrial (ADNmt) o algunas partes del cistrón del ADN ribosómico tienen tasas de mutación relativamente rápidas, que dan una variación significativa en las secuencias entre especies. Los métodos de ADNmt solo son posibles en eucariotas (ya que los procariotas carecen de mitocondrias), mientras que MLST, aunque inicialmente desarrollado para procariotas, ahora encuentra aplicación en eucariotas y, en principio, podría aplicarse a cualquier reino.

Ventajas y aplicaciones

MLST es altamente inequívoco y portátil. Los materiales necesarios para la determinación de ST se pueden intercambiar entre laboratorios. Se puede acceder a las secuencias de cebadores y a los protocolos de forma electrónica. Es reproducible y escalable. MLST está automatizado, combina avances en secuenciación de alto rendimiento y bioinformática con técnicas de genética de poblaciones establecidas. Los datos de MLST se pueden utilizar para investigar las relaciones evolutivas entre bacterias. MLST proporciona un buen poder discriminatorio para diferenciar los aislamientos.

La aplicación de MLST es enorme y proporciona un recurso para las comunidades científica, de salud pública y veterinaria, así como para la industria alimentaria. Los siguientes son ejemplos de aplicaciones MLST.

Campylobacter

Campylobacter es el agente causal común de enfermedades intestinales infecciosas bacterianas, que generalmente surgen de aves de corral poco cocidas o leche no pasteurizada. Sin embargo, su epidemiología es poco conocida ya que los brotes rara vez se detectan, por lo que las fuentes y rutas de transmisión de los brotes no se pueden rastrear fácilmente. Además, losgenomas de Campylobacter son genéticamente diversos e inestables con frecuentes recombinaciones inter e intragenómicas, junto con una variación de fase, lo que complica la interpretación de los datos de muchos métodos de tipificación. Hasta hace poco, con la aplicación de la técnica MLST, latipificación de Campylobacter ha logrado un gran éxito y se ha agregado a la base de datos MLST. Al 1 de mayo de 2008, CampylobacterLa base de datos MLST contiene 3516 aislados y alrededor de 30 publicaciones que usan o mencionan MLST en la investigación sobre Campylobacter ( http://pubmlst.org/campylobacter/ ).

Neisseria meningitidis

MLST ha proporcionado una imagen de una textura más rica de las bacterias dentro de las poblaciones humanas y de las variantes de cepas que pueden ser patógenas para los humanos, las plantas y los animales. La técnica MLST fue utilizada por primera vez por Maiden et al. (1) para caracterizar Neisseria meningitidis utilizando seis loci. La aplicación de MLST ha resuelto claramente los principales linajes meningocócicos que se sabe que son responsables de enfermedades invasivas en todo el mundo. Para mejorar el nivel de poder discriminatorio entre los principales linajes invasores, ahora se están utilizando siete loci y muchos laboratorios los han aceptado como el método de elección para caracterizar los aislados meningocócicos. Es un hecho bien conocido ^[7] que los intercambios recombinacionales ocurren comúnmente en N. meningitidis, lo que conduce a una rápida diversificación de los clones meningocócicos. MLST ha proporcionado con éxito un método confiable para la caracterización de clones dentro de otras especies bacterianas en las que las tasas de diversificación clonal son generalmente más bajas.

Staphylococcus aureus

S. aureus causa varias enfermedades. S. aureus resistente a la meticilina ( MRSA ) ha generado preocupaciones crecientes sobre su resistencia a casi todos los antibióticos excepto a la vancomicina. Sin embargo, la mayoría de las infeccionesgraves por S. aureus en la comunidad, y muchas en los hospitales, son causadas por cepas aisladas sensibles a la meticilina (MSSA) y ha habido pocos intentos de identificar los clones hipervirulentos de MSSA asociados con enfermedades graves. Por lo tanto, MLST se desarrolló para proporcionar un método inequívoco de caracterizar los clones de MRSA y para la identificación de los clones de MSSA asociados con enfermedades graves.

Streptococcus pyogenes

S. pyogenes causa enfermedades que van desde la faringitis hasta el impétigo potencialmente mortal, incluida la fascitis necrotizante. Seha desarrolladoun esquema MLST para S. pyogenes . En la actualidad, la base de datos ( mlst.net ) ^[8] contiene los perfiles alélicos de los aislamientos que representan la diversidad mundial del organismo y los aislamientos de enfermedades invasivas graves. ^[9]

Candida albicans

C. albicans es un hongo patógeno humano y es responsable de las infecciones del torrente sanguíneo adquiridas en el hospital. La técnica MLST se ha utilizado para caracterizaraislados de C. albicans . La combinación de los alelos en los diferentes loci da como resultado tipos de secuencia diploide únicos que pueden usarse para discriminar cepas. Se ha demostrado que MLST se ha aplicado con éxito para estudiar la epidemiología de C. albicans en el hospital, así como la diversidad deaislamientosde C. albicans obtenidos de diversos nichos ecológicos, incluidos huéspedes humanos y animales.

Cronobacter

El género Cronobacter está compuesto por 7 especies. Antes de 2007, se aplicó a estos organismos el nombre de una sola especie Enterobacter sakazakii . El Cronobacter MLST se aplicó inicialmente para distinguir entre C. sakazakii y C. malonaticus porque la secuenciación del rDNA 16S no siempre es lo suficientemente precisa y la biotipificación es demasiado subjetiva. ^[10] El esquema MLST de Cronobacter usa 7 alelos; atpD , fusA , glnS , gltB , gyrB , infB y ppsAdando una secuencia concatenada de 3036 pb para análisis filogenético (MLSA) y genómica comparativa. ^[11] MLST también se ha utilizado en el reconocimiento formal de nuevas especies de Cronobacter . ^[12] El método ha revelado una fuerte asociación entre un linaje genético, secuencia tipo 4 (ST4) y casos de meningitis neonatal. ^[13] El sitio de Cronobacter MLST está en http://www.pubMLST.org/cronobacter .

Limitaciones

MLST aparece mejor en el estudio genético de poblaciones, pero es caro. Debido a la conservación de la secuencia en los genes domésticos, MLST a veces carece del poder discriminatorio para diferenciar cepas bacterianas, lo que limita su uso en investigaciones epidemiológicas. Para mejorar el poder discriminatorio de MLST, se ha desarrollado un enfoque de tipificación de secuencias de locus de virulencia múltiple (MVLST) utilizando Listeria monocytogenes . ^[14]MVLST amplía los beneficios de MLST pero se dirige a los genes de virulencia, que pueden ser más polimórficos que los genes domésticos. La genética de poblaciones no es el único factor relevante en una epidemia. Los factores de virulencia también son importantes para causar enfermedades, y los estudios genéticos de poblaciones luchan por controlarlos. Esto se debe a que los genes implicados son a menudo altamente recombinantes y móviles entre cepas en comparación con el marco genético de la población. Así, por ejemplo, en Escherichia coli , la identificación de cepas que portan genes de toxina es más importante que tener una evaluación basada en la genética poblacional de las cepas prevalentes.

El advenimiento de las tecnologías de secuenciación de segunda generación ha hecho posible obtener información de secuencia en todo el genoma bacteriano a un costo y esfuerzo relativamente modestos, y ahora se puede asignar MLST a partir de la información de secuencia del genoma completo, en lugar de secuenciar cada locus por separado como era el caso. práctica cuando MLST se desarrolló por primera vez. ^[15] La secuenciación del genoma completo proporciona información más rica para diferenciar cepas bacterianas (MLST utiliza aproximadamente el 0,1% de la secuencia genómica para asignar el tipo sin tener en cuenta el resto del genoma bacteriano). Por ejemplo, la secuenciación del genoma completo de numerosos aislamientos ha revelado que el único linaje ST258 de Klebsiella pneumoniae MLST comprende dos clados genéticos distintos, ^[16]proporcionando información adicional sobre la evolución y propagación de estos organismos resistentes a múltiples fármacos, y refutando la hipótesis anterior de un solo origen clonal para ST258. ^[17]

Bases de datos

Las bases de datos MLST contienen las secuencias de alelos de referencia y los tipos de secuencias para cada organismo, y también aíslan datos epidemiológicos. Los sitios web contienen software de interrogación y análisis que permite a los usuarios consultar sus secuencias de alelos y tipos de secuencias. MLST se utiliza ampliamente como herramienta para investigadores y trabajadores de la salud pública.

La mayoría de las bases de datos MLST están alojadas en 2 servidores web ubicados actualmente en Imperial College, Londres ( mlst.net ) y en la Universidad de Oxford ( pubmlst.org ).

Las bases de datos alojadas en cada sitio son diferentes y contienen las secuencias de alelos de referencia específicas del organismo y listas de ST para organismos individuales.

Para ayudar a recopilar y formatear las secuencias utilizadas, se ha desarrollado un complemento simple y gratuito para Firefox ( enlace ).

Referencias

1. Doncella, MC .; Bygraves, JA .; Feil, E .; Morelli, G .; Russell, JE .; Urwin, R .; Zhang, Q .; Zhou, J .; et al. (Marzo de 1998). "Tipificación de secuencia multilocus: un enfoque portátil para la identificación de clones dentro de poblaciones de microorganismos patógenos" . Proc Natl Acad Sci USA . 95 (6): 3140–5. Código Bibliográfico : 1998PNAS ... 95.3140M . doi : 10.1073 / pnas.95.6.3140 . PMC  19708 . PMID  9501229 .
2. Sarris, PF; Trantas, EA; Mpalantinaki, E; Ververidis, F; Goumas, DE (2012). " Pseudomonas viridiflava , un patógeno de plantas multi huésped con variación genética significativa a nivel molecular" . PLOS ONE . 7 (4): e36090. Código Bibliográfico : 2012PLoSO ... 736090S . doi : 10.1371 / journal.pone.0036090 . PMC 3338640 . PMID 22558343 .  
3. Spratt, Brian G (1999). "Tipificación de secuencia multilocus: tipificación molecular de patógenos bacterianos en una era de secuenciación rápida de ADN e Internet". Opinión actual en microbiología . 2 (3): 312–316. doi : 10.1016 / S1369-5274 (99) 80054-X . PMID 10383857 . 
4. Spratt, BG; Doncella, MC (1999). "Genética, evolución y epidemiología de poblaciones bacterianas" . Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci . 354 (1384): 701–710. doi : 10.1098 / rstb.1999.0423 . PMC 1692550 . PMID 10365396 .  
5. Jolley, Keith. "Árbol de expansión mínimo" . pubMLST. Archivado desde el original el 15 de septiembre de 2007 . Consultado el 10 de octubre de 2013 .
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Enlaces externos

• mlst.net - Imperial College de Londres
• PubMLST - Universidad de Oxford
• bases de datos alojadas en University College Cork
• bases de datos del Instituto Pasteur
• BioNumerics Una solución bioinformática universal para almacenar y analizar todos sus datos biológicos. Se puede realizar todo el flujo de trabajo de MLST y comparar los resultados con otros métodos de mecanografía y / o metadatos. Las secuencias de alelos y las ID también pueden derivarse de secuencias del genoma completo.
• El módulo de genómica microbiana de CLC incluye un conjunto de herramientas y flujos de trabajo listos para usar para MLST en el contexto de metainformación como brote, host, ubicación geográfica, etc., y permite una fácil comparación con los resultados de mecanografía obtenidos mediante otros métodos de mecanografía.

Artículos de revistas

• Maiden MC, Bygraves JA, Feil E, et al. (Marzo de 1998). "Tipificación de secuencia multilocus: un enfoque portátil para la identificación de clones dentro de poblaciones de microorganismos patógenos" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 95 (6): 3140–5. Código Bibliográfico : 1998PNAS ... 95.3140M . doi : 10.1073 / pnas.95.6.3140 . PMC  19708 . PMID  9501229 .
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