Reacción en cadena de la polimerasa multiplex

La reacción en cadena de la polimerasa múltiple ( PCR múltiple ) se refiere al uso de la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar varias secuencias de ADN diferentes simultáneamente (como si se realizaran muchas reacciones de PCR separadas todas juntas en una reacción). Este proceso amplifica el ADN en muestras utilizando múltiples cebadores y una ADN polimerasa mediada por temperatura en un termociclador . El diseño de cebadores para todos los pares de cebadores debe optimizarse para que todos los pares de cebadores puedan trabajar a la misma temperatura de hibridación durante la PCR.

La PCR múltiple se describió por primera vez en 1988 como un método para detectar deleciones en el gen de la distrofina . ^[1] También se ha utilizado con el gen esteroide sulfatasa . ^[2] En 2008, se utilizó multiplex-PCR para el análisis de microsatélites y SNP . ^[3] En 2020, se diseñaron ensayos multiplex de RT-PCR que combinaban múltiples dianas genéticas del Centro de Enfermedades y Control en una sola reacción para aumentar la accesibilidad y el rendimiento de las pruebas moleculares para los diagnósticos del SARS-CoV-2 . ^[4]

Multiplex-PCR consiste en múltiples conjuntos de cebadores dentro de una única mezcla de PCR para producir amplicones de diferentes tamaños que son específicos para diferentes secuencias de ADN. Al seleccionar varias secuencias a la vez, se puede obtener información adicional de una sola ejecución de prueba que, de otro modo, requeriría varias veces los reactivos y más tiempo para realizarse. Las temperaturas de recocido para cada uno de los conjuntos de cebadores deben optimizarse para que funcionen correctamente dentro de una sola reacción, y los tamaños de los amplicones, es decir, la longitud del par de bases, deben ser lo suficientemente diferentes para formar bandas distintas cuando se visualizan mediante electroforesis en gel.. Alternativamente, si los tamaños de los amplicones se superponen, los diferentes amplicones se pueden diferenciar y visualizar usando cebadores que se han teñido con tintes fluorescentes de diferentes colores. Los kits comerciales de multiplexación para PCR están disponibles y son utilizados por muchos laboratorios forenses para amplificar muestras de ADN degradado.

Aplicaciones

Algunas de las aplicaciones de la PCR multiplex incluyen:

1. Identificación de patógenos ^[5]
2. Genotipado SNP de alto rendimiento ^[6]
3. Análisis de mutaciones ^[7]
4. Análisis de eliminación de genes ^[8]
5. Cuantificación de plantilla ^[9]
6. Análisis de vinculación ^[10]
7. Detección de ARN ^[11]
8. Estudios forenses ^[12]
9. Análisis de la dieta ^[13]

Referencias

1. Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Nguyen PN, Caskey CT (1988). "Detección de deleciones del locus de distrofia muscular de Duchenne mediante amplificación de ADN multiplex" . Investigación de ácidos nucleicos . 16 (23): 11141-11156. doi : 10.1093 / nar / 16.23.11141 . PMC  339001 . PMID  3205741 .
2. Ballabio A, Ranier JE, Chamberlain JS, Zollo M, Caskey CT (1990). "Detección de deleciones del gen esteroide sulfatasa (STS) mediante amplificación de ADN multiplex" (PDF) . Genética humana . 84 (6): 571–573. doi : 10.1007 / BF00210812 . hdl : 2027,42 / 47626 . PMID 2338343 . S2CID 18579745 .   
3. Hayden MJ, Nguyen TM, Waterman A, Chalmers KJ (2008). "PCR multiplex-ready: un nuevo método para genotipado SSR y SNP multiplexado" . BMC Genomics . 9 : 80. doi : 10.1186 / 1471-2164-9-80 . PMC 2275739 . PMID 18282271 .  
4. Perchetti, GA; Nalla, AK; Huang, ML; Jerome, KR; Greninger, Alabama (2020). "Multiplexación de conjuntos de cebadores / sondas para la detección de SARS-CoV-2 por qRT-PCR" . Revista de Virología Clínica . 129 : 104499. doi : 10.1016 / j.jcv.2020.104499 . PMC 7278635 . PMID 32535397 .  
5. Järvinen, Anna-Kaarina; Laakso, Sanna; Piiparinen, Pasi; Aittakorpi, Anne; Lindfors, Merja; Huopaniemi, Laura; Piiparinen, Heli; Mäki, Minna (2009). "Identificación rápida de patógenos bacterianos mediante un ensayo basado en PCR y microarrays" . Microbiología BMC . 9 : 161. doi : 10.1186 / 1471-2180-9-161 . PMC 2741468 . PMID 19664269 .  
6. Myakishev, MV (2001). "Genotipado de SNP de alto rendimiento por PCR de alelos específicos con cebadores universales etiquetados con transferencia de energía" . Investigación del genoma . 11 (1): 163–169. doi : 10.1101 / gr.157901 . PMC 311033 . PMID 11156625 .  
7. Morlan, John; Baker, Joffre; Sinicropi, Dominick (2009). "Detección de mutaciones por PCR en tiempo real: un método simple, robusto y altamente selectivo" . PLOS ONE . 4 (2): e4584. Código Bibliográfico : 2009PLoSO ... 4.4584M . doi : 10.1371 / journal.pone.0004584 . PMC 2642996 . PMID 19240792 .  
8. Abbs, S; Bobrow, M (1992). "Análisis de PCR cuantitativa para el diagnóstico de portadores de deleción y duplicación en el gen de la distrofina" . Revista de Genética Médica . 29 (3): 191-196. doi : 10.1136 / jmg.29.3.191 . PMC 1015896 . PMID 1552558 .  
9. "Bienvenido | Servicio de elaboración de perfiles de ADN forense" (PDF) .
10. Reis, Andre (1991). "PCR en análisis de ligamiento de enfermedades genéticas". Temas de PCR . págs. 75–79. doi : 10.1007 / 978-3-642-75924-6_15 . ISBN 978-3-540-52934-7.
11. Miyakawa, Y .; Yoshizawa, H .; Mishiro, S .; Machida, A .; Akahane, Y .; Sugai, Y .; Tanaka, T .; Sugiyama, Y .; Okada, S .; Okamoto, H. (agosto de 1990). "Detección del ARN del virus de la hepatitis C mediante una reacción en cadena de la polimerasa en dos etapas con dos pares de cebadores deducidos de la región no codificante 5 '". La Revista Japonesa de Medicina Experimental . 60 (4): 215-222. PMID 1963453 . 
12. "Evidencia de ADN: conceptos básicos del análisis" .
13. Dunshea, Glenn (2009). "Análisis de la dieta basada en ADN para cualquier depredador" . PLOS ONE . 4 (4): e5252. Código Bibliográfico : 2009PLoSO ... 4.5252D . doi : 10.1371 / journal.pone.0005252 . PMC 2668750 . PMID 19390570 .