La ligadura química nativa o NCL es una extensión importante del campo de la ligadura química , un concepto para construir un polipéptido grande formado por el ensamblaje de dos o más segmentos de péptidos no protegidos. [1] Especialmente, NCL es el método de ligación más poderoso para sintetizar proteínas nativas de la columna vertebral o proteínas modificadas de tamaño moderado ( es decir , proteínas pequeñas <200 AA).
Reacción
En la ligadura química nativa, el grupo tiol de un residuo de cisteína N-terminal de un péptido 2 desprotegido ataca el tioéster C-terminal de un segundo péptido 1 desprotegido en un tampón acuoso a pH 7,0, 20 ° C
Observaciones:
- Aditivos de tiol:
La reacción de NCL se cataliza mediante transtioesterificación in situ con aditivos de tiol. Los catalizadores de tiol más comunes hasta la fecha han sido una mezcla de tiofenilo, ácido 4-mercaptofenilacético (MPAA) o 2-mercaptoetanosulfonato (MESNa). (árbitro)
- Regioselectividad de NCL:
La propiedad principal del método NCL es la reversibilidad del primer paso , la reacción de intercambio de tiol (ato) -tioéster. La ligadura química nativa es exquisitamente regioselectiva porque la etapa de intercambio de tiol (ato) -tioéster es libremente reversible en presencia de un tiol exógeno añadido como catalizador. Los altos rendimientos del producto de ligación final obtenido, incluso en presencia de residuos de Cys internos en uno o ambos segmentos, es el resultado de la irreversibilidad, en las condiciones de reacción utilizadas, de la segunda (cambio de acilo S-a-N) amida- paso de formación.
- Quimioselectividad de NCL:
No se forman productos secundarios a partir de la reacción con los otros grupos funcionales presentes en ninguno de los segmentos peptídicos (ácidos o grupos amino básicos, hidroxilos fenólicos, etc.).
Contexto histórico
En 1953, Theodor Wieland y sus colaboradores descubrieron la base química de esta reacción, cuando se demostró que la reacción del tioéster de valina y el aminoácido cisteína en un tampón acuoso producía el dipéptido valina-cisteína. [2] La reacción procedió a través de la intermediación de un tioéster que contenía el azufre del residuo de cisteína. El trabajo de Wieland condujo al método del "éster activo" para fabricar segmentos de péptidos protegidos en la síntesis de solución convencional en disolventes orgánicos.
En la década de 1990, Stephen Kent y sus colaboradores del Instituto de Investigación Scripps desarrollaron de forma independiente la "Ligadura Química Nativa", el primer método práctico para ligar grandes fragmentos de péptidos desprotegidos.
Propiedades
La ligadura química nativa se lleva a cabo en solución acuosa y frecuentemente da rendimientos casi cuantitativos del producto de ligadura deseado. El desafío radica en la preparación del bloque de construcción de péptido-tioéster desprotegido necesario. Los tioésteres de péptidos se preparan normalmente mediante Boc Chemistry SPPS ; un péptido que contiene tioéster no se puede sintetizar usando una base nucleofílica, desfavoreciendo así la química de Fmoc. Se conocen técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida de química Fmoc para generar tioésteres de péptidos; utilizan modificaciones del enlazador de "captura de seguridad" de Kenner. Al fabricar segmentos de péptidos para usar en la ligadura química nativa, deben evitarse los grupos protectores que liberan aldehídos o cetonas , ya que estos pueden cubrir la cisteína N-terminal. Por la misma razón, debe evitarse el uso de acetona , especialmente antes de la liofilización y en el lavado de cristalería.
Una característica de la técnica de ligadura química nativa es que la cadena polipeptídica del producto contiene cisteína en el sitio de ligadura. Para algunas proteínas, la homocisteína puede usarse y metilarse después de la ligadura para formar metionina , aunque pueden ocurrir reacciones secundarias en esta etapa de alquilación. La cisteína en el sitio de ligación también se puede desulfurar a alanina ; más recientemente, se han utilizado otros aminoácidos que contienen beta-tiol para la ligadura química nativa, seguida de desulfuración. Alternativamente, se pueden usar auxiliares de ligación que contienen tiol que imitan una cisteína N-terminal para la reacción de ligación, pero que se pueden eliminar después de la síntesis. El uso de auxiliares que contienen tiol no es tan eficaz como la ligación en un residuo de Cys. La ligadura química nativa también se puede realizar con un residuo de selenocisteína N-terminal. [3]
La recompensa del método de ligación química nativa es que el acoplamiento de péptidos largos mediante esta técnica es en muchos casos casi cuantitativo y proporciona acceso sintético a péptidos y proteínas de gran tamaño que de otro modo serían imposibles de producir, debido a la longitud o decoración por modificación postraduccional. La ligadura química nativa forma la base de la síntesis química de proteínas moderna y se ha utilizado para preparar numerosas proteínas y enzimas mediante síntesis química total.
Los tioésteres del polipéptido C-terminal producidos mediante técnicas de ADN recombinante pueden reaccionar con un polipéptido que contiene Cys N-terminal mediante la misma química de ligación nativa para proporcionar proteínas semisintéticas muy grandes. La ligadura química nativa de este tipo usando un segmento de polipéptido recombinante se conoce como ligadura de proteína expresada. De manera similar, una proteína recombinante que contiene una Cys N-terminal se puede hacer reaccionar con un tioéster de polipéptido sintético. Por tanto, la ligadura química nativa puede usarse para introducir segmentos sintetizados químicamente en proteínas recombinantes, independientemente del tamaño.
Los tioésteres polipeptídicos C-terminales también se pueden producir in situ , utilizando los denominados sistemas de desplazamiento N, S -acilo. El grupo bis (2-sulfaniletil) amido, también llamado grupo SEA, pertenece a esta familia. El polipéptido C-terminal bis (2-sulfaniletil) amidas (segmentos de péptidos SEA) reaccionan con el péptido Cys para dar un enlace peptídico nativo como en NCL. Esta reacción, que se denomina ligadura de péptidos nativos de SEA , es una extensión útil de la ligadura química nativa. [4] [5]
Limitación de tamaño
Se ha demostrado que NCL es un método conveniente para la síntesis química de proteínas de más de 100 aminoácidos de longitud, como se demuestra en la cadena polipeptídica de 166 aminoácidos de la variante sintética de eritropoyetina y la proteasa de VIH-1 de 203 aminoácidos.
Ver también
Referencias
- ^ Dawson, PE; Muir, TW; Clark-Lewis, I .; Kent, SB (1994). "Síntesis de proteínas por ligadura química nativa". Ciencia . 266 (5186): 776–778. Bibcode : 1994Sci ... 266..776D . doi : 10.1126 / science.7973629 . PMID 7973629 .
- ^ Wieland, T .; Bokelmann, E .; Bauer, L .; Lang, HU; Lau, H (1953). "Über Peptidsynthesen. 8. Mitteilung Bildung von S-haltigen Peptiden durch intramolekulare Wanderung von Aminoacylresten". Liebigs Ann. Chem . 583 : 129-149. doi : 10.1002 / jlac.19535830110 .
- ^ McGrath, NA; Raines, RT (2011). "Quimioselectividad en biología química: reacciones de transferencia de acilo con azufre y selenio" . Acc. Chem. Res . 44 (9): 752–761. doi : 10.1021 / ar200081s . PMC 3242736 . PMID 21639109 .
- ^ Ollivier, N. Dheur, J. Mhidia, R. Blanpain, A. Melnyk, O. (2010). "Ligación de péptidos nativos de bis (2-sulfaniletil) amino". Letras orgánicas . 12 (22): 5238–41. doi : 10.1021 / ol102273u . PMID 20964289 .CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
- ^ Melnyk, O .; et al. "(WO2011051906) MÉTODO PARA LA LIGACIÓN NATIVA DE POLIPÉPTIDOS" . Solicitud de patente WO .
Otras lecturas
- Muir TW; Sondhi D .; Cole PA (1998). "Ligadura de proteínas expresadas: un método general para la ingeniería de proteínas" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 95 (12): 6705–6710. Código bibliográfico : 1998PNAS ... 95.6705M . doi : 10.1073 / pnas.95.12.6705 . PMC 22605 . PMID 9618476 .
- Nilsson BL; Soellner MB; Raines RT (2005). "Síntesis química de proteínas" . Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct . 34 : 91-118. doi : 10.1146 / annurev.biophys.34.040204.144700 . PMC 2845543 . PMID 15869385 .