En biología molecular , la cuantificación de ácidos nucleicos se realiza comúnmente para determinar las concentraciones promedio de ADN o ARN presentes en una mezcla, así como su pureza. Las reacciones que utilizan ácidos nucleicos a menudo requieren cantidades particulares y pureza para un rendimiento óptimo. Hasta la fecha, los científicos utilizan dos enfoques principales para cuantificar o establecer la concentración de ácidos nucleicos (como el ADN o el ARN) en una solución. Estos son la cuantificación espectrofotométrica y el etiquetado de fluorescencia UV en presencia de un tinte de ADN. [ cita requerida ]
Análisis espectrofotométrico
Una de las prácticas más comúnmente utilizadas para cuantificar ADN o ARN es el uso de análisis espectrofotométrico usando un espectrofotómetro . [1] Un espectrofotómetro puede determinar las concentraciones medias de los ácidos nucleicos ADN o ARN presentes en una mezcla, así como su pureza.
El análisis espectrofotométrico se basa en los principios de que los ácidos nucleicos absorben la luz ultravioleta en un patrón específico. En el caso de ADN y ARN, una muestra se expone a luz ultravioleta a una longitud de onda de 260 nanómetros (nm) y un fotodetector mide la luz que atraviesa la muestra. Parte de la luz ultravioleta pasará y parte será absorbida por el ADN / ARN. Cuanto más luz absorba la muestra, mayor será la concentración de ácido nucleico en la muestra. El efecto resultante es que entrará menos luz en el fotodetector y esto producirá una mayor densidad óptica (DO).
Usando la ley de Beer-Lambert es posible relacionar la cantidad de luz absorbida con la concentración de la molécula absorbente. A una longitud de onda de 260 nm, el coeficiente de extinción promedio para el ADN bicatenario es 0.020 (μg / ml) -1 cm -1 , para el ADN monocatenario es 0.027 (μg / ml) -1 cm -1 , para el simple El ARN de hebra es de 0,025 (μg / ml) -1 cm -1 y para los oligonucleótidos monocatenarios cortos depende de la longitud y la composición de la base. Por tanto, una absorbancia (A) de 1 corresponde a una concentración de 50 μg / ml para el ADN bicatenario. Este método de cálculo es válido hasta una A de al menos 2. [2] Puede ser necesario un coeficiente de extinción más preciso para los oligonucleótidos; estos se pueden predecir utilizando el modelo del vecino más cercano . [3]
Cálculos
La densidad óptica [4] se genera a partir de la ecuación:
- Densidad óptica = Log (intensidad de la luz incidente / intensidad de la
luz transmitida)
En términos prácticos, una muestra que no contiene ADN o ARN no debería
absorber nada de luz ultravioleta y, por lo tanto, producir una DO de 0
Densidad óptica = Log (100/100) = 0
Cuando se usa un análisis espectrofotométrico para determinar la concentración de ADN o ARN, se usa la ley de Beer-Lambert para determinar concentraciones desconocidas sin la necesidad de curvas estándar. En esencia, la Ley de Beer Lambert permite relacionar la cantidad de luz absorbida con la concentración de la molécula absorbente. Las siguientes unidades de absorbancia en factores de conversión de concentración de ácido nucleico se utilizan para convertir la DO en concentración de muestras de ácido nucleico desconocidas:
- A260 dsDNA = 50 µg / ml
- ADNss A260 = 33 µg / ml
- SsRNA A260 = 40 µg / ml
Factores de conversión
Cuando utilice una longitud de trayectoria de 10 mm , simplemente multiplique el OD por el factor de conversión para determinar la concentración. Por ejemplo, una muestra de dsDNA de 2,0 OD corresponde a una muestra con una concentración de 100 µg / ml.
Cuando se utiliza una longitud de trayectoria inferior a 10 mm, el diámetro exterior resultante se reducirá en un factor de 10 / longitud de trayectoria. Utilizando el ejemplo anterior con una longitud de paso de 3 mm, la DO de la muestra de 100 µg / ml se reduciría a 0,6. Para normalizar la concentración a un equivalente de 10 mm, se hace lo siguiente:
0,6 OD X (10/3) * 50 µg / ml = 100 µg / ml
La mayoría de los espectrofotómetros permiten la selección del tipo de ácido nucleico y la longitud de la ruta de modo que la concentración resultante se normalice a la longitud de la ruta de 10 mm, que se basa en los principios de la ley de Beer .
A260 como medida de cantidad
La "unidad A260" se utiliza como medida de cantidad de ácidos nucleicos. Una unidad A260 es la cantidad de ácido nucleico contenida en 1 ml y que produce una DO de 1. Se aplican los mismos factores de conversión y, por lo tanto, en tales contextos:
- 1 unidad A260 dsDNA = 50 µg
- 1 unidad A260 ssDNA = 33 µg
- 1 unidad A260 ssRNA = 40 µg
Pureza de la muestra (proporciones 260: 280/260: 230)
Es común que las muestras de ácido nucleico estén contaminadas con otras moléculas (es decir, proteínas, compuestos orgánicos, otros). El beneficio secundario de usar el análisis espectrofotométrico para la cuantificación de ácidos nucleicos es la capacidad de determinar la pureza de la muestra usando el cálculo de 260 nm: 280 nm. La relación de absorbancia a 260 y 280 nm (A 260/280 ) se usa para evaluar la pureza de los ácidos nucleicos. Para el ADN puro, A 260/280 se considera ampliamente ~ 1.8, pero se ha argumentado que se traduce, debido a errores numéricos en el artículo original de Warburg, en una mezcla de 60% de proteína y 40% de ADN. [5] La relación para el ARN A 260/280 puro es ~ 2,0. Estas proporciones se utilizan comúnmente para evaluar la cantidad de contaminación de proteínas que queda del proceso de aislamiento de ácidos nucleicos, ya que las proteínas se absorben a 280 nm.
La proporción de absorbancia a 260 nm frente a 280 nm se usa comúnmente para evaluar la contaminación por ADN de soluciones de proteínas , ya que las proteínas (en particular, los aminoácidos aromáticos) absorben la luz a 280 nm. [2] [6] Lo contrario, sin embargo, no es cierto: se necesita una cantidad relativamente grande de contaminación de proteínas para afectar significativamente la proporción 260: 280 en una solución de ácido nucleico. [2] [5]
La relación 260: 280 tiene una alta sensibilidad para la contaminación de ácidos nucleicos en proteínas:
% de proteína | % ácido nucleico | Relación 260: 280 |
---|---|---|
100 | 0 | 0,57 |
95 | 5 | 1.06 |
90 | 10 | 1,32 |
70 | 30 | 1,73 |
La proporción 260: 280 carece de sensibilidad para la contaminación de proteínas en los ácidos nucleicos (la tabla que se muestra para el ARN, el 100% del ADN es aproximadamente 1.8):
% ácido nucleico | % de proteína | Relación 260: 280 |
---|---|---|
100 | 0 | 2,00 |
95 | 5 | 1,99 |
90 | 10 | 1,98 |
70 | 30 | 1,94 |
Esta diferencia se debe al coeficiente de atenuación de masa mucho más alto que tienen los ácidos nucleicos a 260 nm y 280 nm, en comparación con el de las proteínas. Debido a esto, incluso para concentraciones relativamente altas de proteína, la proteína contribuye relativamente poco a la absorbancia 260 y 280. Si bien la contaminación de la proteína no se puede evaluar de manera confiable con una proporción de 260: 280, esto también significa que contribuye con un pequeño error en la estimación de la cantidad de ADN.
Identificación de contaminación
El examen de los espectros de la muestra puede ser útil para identificar que existe un problema con la pureza de la muestra.
Proporción | Lectura baja | Lectura alta |
---|---|---|
A260 / A230 |
|
|
A260 / A280 |
|
* Las relaciones de pureza altas de 260/280 normalmente no son indicativas de ningún problema. |
Otros contaminantes comunes
- La contaminación por fenol , que se usa comúnmente en la purificación de ácidos nucleicos, puede alterar significativamente las estimaciones de cuantificación. El fenol se absorbe con un pico a 270 nm y una A 260/280 de 1,2. Las preparaciones de ácido nucleico no contaminadas por fenol deben tener un A 260/280 de alrededor de 2. [2] La contaminación por fenol puede contribuir significativamente a sobrestimar la concentración de ADN.
- La absorción a 230 nm puede deberse a la contaminación por iones fenolato , tiocianatos y otros compuestos orgánicos. Para una muestra de ARN puro, el A 230: 260: 280 debe estar alrededor de 1: 2: 1, y para una muestra de ADN puro, el A 230: 260: 280 debe estar alrededor de 1: 1.8: 1. [8]
- La absorción a 330 nm y más indica partículas que contaminan la solución, causando la dispersión de la luz en el rango visible. El valor en una muestra de ácido nucleico puro debe ser cero. [ cita requerida ]
- Pueden producirse valores negativos si se utiliza una solución incorrecta como blanco. Alternativamente, estos valores podrían surgir debido a la fluorescencia de un tinte en la solución.
Análisis con etiquetado con colorante fluorescente
Un método alternativo para evaluar la concentración de ADN y ARN es marcar la muestra con una etiqueta fluorescente , que es un tinte fluorescente que se utiliza para medir la intensidad de los tintes que se unen a los ácidos nucleicos y emiten una fluorescencia selectiva cuando se unen (por ejemplo , bromuro de etidio ). Este método es útil para los casos en que la concentración es demasiado baja para evaluar con precisión con espectrofotometría y en los casos en que los contaminantes que se absorben a 260 nm hacen imposible una cuantificación precisa mediante ese método. El beneficio de la cuantificación de fluorescencia de ADN y ARN es la sensibilidad mejorada sobre el análisis espectrofotométrico . Sin embargo, ese aumento en la sensibilidad tiene el costo de un precio más alto por muestra y un proceso de preparación de la muestra más largo .
Hay dos formas principales de abordar esto. El "manchado" implica colocar una muestra directamente sobre un gel de agarosa o una envoltura de plástico . El tinte fluorescente está presente en el gel de agarosa o se agrega en concentraciones apropiadas a las muestras en la película plástica. Junto a la muestra se coloca un conjunto de muestras con concentraciones conocidas. A continuación, se estima la concentración de la muestra desconocida comparándola con la fluorescencia de estas concentraciones conocidas. Alternativamente, se puede pasar la muestra a través de un gel de agarosa o poliacrilamida , junto con algunas muestras de concentración conocida. Al igual que con la prueba puntual, la concentración se estima mediante la comparación de la intensidad fluorescente con las muestras conocidas. [2]
Si los volúmenes de muestra son lo suficientemente grandes como para usar microplacas o cubetas , las muestras cargadas de colorante también se pueden cuantificar con un fotómetro de fluorescencia . El volumen mínimo de muestra comienza en 0,3 μl [9]
Hasta la fecha, no existe un método de fluorescencia para determinar la contaminación de proteínas de una muestra de ADN que sea similar a la versión espectrofotométrica de 260 nm / 280 nm.
Ver también
- Métodos de ácido nucleico
- Extracción de fenol-cloroformo
- Purificación de columna
- Métodos proteicos
Referencias
- ^ Huss, Volker AR; Festl, Herbert; Schleifer, Karl Heinz (1983). "Estudios sobre la determinación espectrofotométrica de la hibridación del ADN a partir de tasas de renaturalización". Microbiología sistemática y aplicada . 4 (2): 184-192. doi : 10.1016 / S0723-2020 (83) 80048-4 . ISSN 0723-2020 . PMID 23194591 .
- ^ a b c d e Sambrook y Russell (2001). Clonación molecular: un manual de laboratorio (3ª ed.). Prensa de laboratorio de Cold Spring Harbor . ISBN 978-0-87969-577-4.
- ^ Tataurov AV; Tú Y .; Owczarzy R. (2008). "Predicción del espectro ultravioleta de ácidos desoxirribonucleicos monocatenarios y bicatenarios". Biophys. Chem . 133 (1-3): 66-70. doi : 10.1016 / j.bpc.2007.12.004 . PMID 18201813 .
- ^ IUPAC, Compendio de terminología química . Edición online: "absorbancia".
- ^ a b Glasel J. (1995). "Validez de las purezas de los ácidos nucleicos controladas por ratios de absorbancia 260/280". BioTechniques . 18 (1): 62–63. PMID 7702855 .)
- ^ (Sambrook y Russell citan el artículo original: Warburg, O. y Christian W. (1942). "Isolierung und Kristallisation des Gärungsferments Enolase". Biochem. Z . 310 : 384–421.)
- ^ "Evaluación de la pureza de los ácidos nucleicos" (PDF) . Thermo Scientific . Consultado el 28 de septiembre de 2016 .
- ^ "El análisis de ADN o ARN utilizando sus longitudes de onda: 230 nm, 260 nm, 280 nm" . Bioteachnology.com. 2010-01-13. Archivado desde el original el 6 de septiembre de 2012 . Consultado el 12 de marzo de 2010 .
- ^ Precisión y reproducibilidad de la cuantificación de ácidos nucleicos
enlaces externos
- Herramienta en línea IDT para predecir el espectro de absorción UV de nucleótidos
- Guía de Ambion para la cuantificación de ARN
- Hillary Luebbehusen, La importancia de la relación 260/230 en la determinación de la pureza de los ácidos nucleicos (documento pdf)
- Cuantificación de ADN y ARN bicatenario y monocatenario mediante absorción de 260 nm, laboratorio Sauer en OpenWetWare
- Aplicación web de absorbancia a concentración @ DNA.UTAH.EDU
- Precisión y reproducibilidad de la cuantificación de ácidos nucleicos