Los oligonucleótidos son moléculas cortas de ADN o ARN , oligómeros , que tienen una amplia gama de aplicaciones en pruebas genéticas , investigación y medicina forense . Comúnmente fabricados en el laboratorio mediante síntesis química en fase sólida , [1] estos pequeños fragmentos de ácidos nucleicos se pueden fabricar como moléculas monocatenarias con cualquier secuencia especificada por el usuario, por lo que son vitales para la síntesis de genes artificiales , la reacción en cadena de la polimerasa (PCR ), secuenciación de ADN , clonación molecular y como sondas moleculares. En la naturaleza, los oligonucleótidos generalmente se encuentran como pequeñas moléculas de ARN que funcionan en la regulación de la expresión génica (por ejemplo , microARN ), [2] o son intermediarios de degradación derivados de la descomposición de moléculas de ácido nucleico más grandes.
Los oligonucleótidos se caracterizan por la secuencia de residuos de nucleótidos que forman la molécula completa. La longitud del oligonucleótido generalmente se indica con " -mer " (del griego meros , "parte"). Por ejemplo, un oligonucleótido de seis nucleótidos (nt) es un hexámero, mientras que uno de 25 nt normalmente se denominaría "25-mer". Los oligonucleótidos se unen fácilmente, de una manera específica de secuencia, a sus respectivos oligonucleótidos, ADN o ARN complementarios para formar dúplex o, con menos frecuencia, híbridos de un orden superior. Esta propiedad básica sirve como base para el uso de oligonucleótidos como sondas.para detectar secuencias específicas de ADN o ARN. Ejemplos de procedimientos que usan oligonucleótidos incluyen micromatrices de ADN , transferencias Southern , análisis ASO , [3] hibridación fluorescente in situ (FISH), PCR y la síntesis de genes artificiales.
Los oligonucleótidos están compuestos por 2'-desoxirribonucleótidos (oligodesoxirribonucleótidos), que pueden modificarse en la columna vertebral o en la posición 2' del azúcar para lograr diferentes efectos farmacológicos. Estas modificaciones otorgan nuevas propiedades a los oligonucleótidos y los convierten en un elemento clave en la terapia antisentido . [4] [5]
Los oligonucleótidos se sintetizan químicamente utilizando bloques de construcción, fosforamiditos protegidos de nucleósidos naturales o modificados químicamente o, en menor medida, de compuestos no nucleosídicos. El ensamblaje de la cadena de oligonucleótidos procede en la dirección 3' a 5' siguiendo un procedimiento de rutina denominado "ciclo sintético". La finalización de un solo ciclo sintético da como resultado la adición de un residuo de nucleótido a la cadena en crecimiento. Un rendimiento inferior al 100% de cada paso sintético y la aparición de reacciones secundarias establecen límites prácticos de la eficiencia del proceso. En general, las secuencias de oligonucleótidos suelen ser cortas (13-25 nucleótidos de largo). [6] La longitud máxima de los oligonucleótidos sintéticos apenas supera los 200 residuos de nucleótidos.Se pueden usar HPLC y otros métodos para aislar productos con la secuencia deseada.
La creación de oligonucleótidos cortos químicamente estables fue el primer desafío en el desarrollo de terapias ASO. Los oligonucleótidos naturales se degradan fácilmente por las nucleasas, una enzima que escinde los nucleótidos y es abundante en todo tipo de células. [7] Las secuencias de oligonucleótidos cortas también tienen afinidades de unión intrínsecas débiles, lo que contribuye a su degradación in vivo. [8]
Los análogos de nucleósidos organotiofosfato (PS) de nucleótidos dan a los oligonucleótidos algunas propiedades beneficiosas. Las propiedades beneficiosas clave que los esqueletos de PS otorgan a los nucleótidos son la identificación de diastereoisómeros de cada nucleótido y la capacidad de seguir fácilmente las reacciones que involucran a los nucleótidos de fosforotioato, lo cual es útil en la síntesis de oligonucleótidos. [9] Las modificaciones de la columna vertebral de PS en los oligonucleótidos los protegen contra la degradación no deseada por parte de las enzimas. [10] La modificación del esqueleto de nucleótidos se usa ampliamente porque se puede lograr con relativa facilidad y precisión en la mayoría de los nucleótidos. [9]Se informaron modificaciones fluorescentes en los extremos 5' y 3' de los oligonucleótidos para evaluar las estructuras, la dinámica y las interacciones de los oligonucleótidos con respecto al medio ambiente. [11]