La fosfoproteómica es una rama de la proteómica que identifica, cataloga y caracteriza proteínas que contienen un grupo fosfato como una modificación postraduccional . La fosforilación es una modificación reversible clave que regula la función de las proteínas, la localización subcelular, la formación de complejos, la degradación de proteínas y, por lo tanto , las redes de señalización celular . Con todos estos resultados de modificación, se estima que entre el 30% y el 65% de todas las proteínas pueden estar fosforiladas, algunas veces varias veces. [1] [2]Según estimaciones estadísticas de muchos conjuntos de datos, deberían existir 230.000, 156.000 y 40.000 sitios de fosforilación en humanos, ratones y levaduras, respectivamente. [2]
En comparación con el análisis de expresión, la fosfoproteómica proporciona dos capas adicionales de información. Primero, proporciona pistas sobre qué proteína o vía podría activarse porque un cambio en el estado de fosforilación casi siempre refleja un cambio en la actividad de la proteína. En segundo lugar, indica qué proteínas podrían ser posibles dianas farmacológicas, como lo ejemplifica el inhibidor de la quinasa Gleevec. Si bien la fosfoproteómica ampliará en gran medida el conocimiento sobre la cantidad y los tipos de fosfoproteínas, su mayor promesa es el análisis rápido de redes de señalización basadas en fosforilación completas. [3]
Descripción general
Una muestra de análisis fosfoproteómico a gran escala incluye células cultivadas sometidas a codificación SILAC ; las células se estimulan con un factor de interés (por ejemplo, factor de crecimiento, hormona); la estimulación puede ocurrir durante varios períodos de tiempo para el análisis temporal, las células se lisan y se digieren enzimáticamente, los péptidos se separan usando cromatografía de intercambio iónico ; fosfopéptidos se enriquecen usando fosfoespecíficos anticuerpos , inmovilizado de metal cromatografía de afinidad o dióxido de titanio (TiO 2 ) cromatografía ; los fosfopéptidos se analizan usando espectrometría de masas y los péptidos se secuencian y analizan. [4]
Herramientas y metodos
El análisis de todo el complemento de proteínas fosforiladas en una célula es ciertamente una opción factible. Esto se debe a la optimización de los protocolos de enriquecimiento de fosfoproteínas y fosfopéptidos, mejores técnicas de fraccionamiento mediante cromatografía y mejora de los métodos para visualizar selectivamente residuos fosforilados mediante espectrometría de masas. Aunque los procedimientos actuales para el análisis fosfoproteómico han mejorado enormemente, todavía hay pérdida de muestras e inconsistencias con respecto a la preparación, el enriquecimiento y la instrumentación de las muestras. Las herramientas bioinformáticas y las bases de datos de secuencias biológicas también son necesarias para los estudios fosfoproteómicos de alto rendimiento. [5]
Estrategias de enriquecimiento
Los procedimientos anteriores para aislar proteínas fosforiladas incluían marcaje radiactivo con ATP marcado con 32 P seguido de electroforesis en gel de poliacrilamida SDS o cromatografía en capa fina. Estos métodos tradicionales son ineficaces porque es imposible obtener grandes cantidades de proteínas necesarias para el análisis de fosforilación. Por lo tanto, los métodos actuales y más simples para enriquecer fosfoproteínas son la purificación por afinidad usando anticuerpos fosfoespecíficos, cromatografía de afinidad de metales inmovilizados ( IMAC ), cromatografía de intercambio catiónico fuerte (SCX) o cromatografía de dióxido de titanio. Se ha demostrado que los anticuerpos antifosfotirosina tienen mucho éxito en la purificación, pero se han publicado menos informes que utilizan anticuerpos contra proteínas que contienen fosfoserina o fosfotreonina. El enriquecimiento de IMAC se basa en la afinidad del fosfato por el metal inmovilizado quelado con la resina. SCX separa los péptidos fosforilados de los no fosforilados basándose en el grupo fosfato cargado negativamente. La cromatografía con dióxido de titanio es una técnica más nueva que requiere un tiempo de preparación de la columna significativamente menor. Muchos estudios fosfoproteómicos utilizan una combinación de estas estrategias de enriquecimiento para obtener la muestra más pura posible.
Análisis de espectrometría de masas
La espectrometría de masas es actualmente el mejor método para comparar adecuadamente pares de muestras de proteínas. Los dos procedimientos principales para realizar esta tarea son el uso de etiquetas de afinidad codificadas por isótopos (ICAT) y aminoácidos isotópicos estables en cultivo celular (SILAC). En el procedimiento ICAT, las muestras se etiquetan individualmente después del aislamiento con reactivos codificados en masa que modifican los residuos de cisteína. En SILAC, las células se cultivan por separado en presencia de diferentes aminoácidos marcados isotópicamente para varias divisiones celulares, lo que permite que las proteínas celulares incorporen el marcador. La espectrometría de masas se utiliza posteriormente para identificar péptidos que contienen fosfoserina, fosfotreonina y fosfotirosina. [6]
Estudios de transducción de señales
La transducción de señales intracelulares está mediada principalmente por la fosforilación reversible de varias moléculas de señalización por enzimas denominadas quinasas . Las quinasas transfieren grupos fosfato del ATP a residuos específicos de serina , treonina o tirosina de las moléculas diana. La proteína fosforilada resultante puede tener un nivel de actividad, una localización subcelular o una estructura terciaria alterados.
Los análisis fosfoproteómicos son ideales para el estudio de la dinámica de las redes de señalización. En un diseño de estudio, las células se exponen al etiquetado SILAC y luego se estimulan mediante un factor de crecimiento específico. Las células se recogen en varios puntos de tiempo y los lisados se combinan para su análisis mediante EM en tándem. [4] Esto permite a los experimentadores rastrear el estado de fosforilación de muchas fosfoproteínas en la célula a lo largo del tiempo. La capacidad de medir el estado de fosforilación global de muchas proteínas en varios momentos hace que este enfoque sea mucho más poderoso que los métodos bioquímicos tradicionales para analizar el comportamiento de la red de señalización. [7]
Un estudio pudo medir simultáneamente el cambio de veces en el estado de fosforilación de 127 proteínas entre células no estimuladas y estimuladas con EphrinB1. [8] De estas 127 proteínas, 40 mostraron un aumento de la fosforilación con estimulación por EphrinB1. Los investigadores pudieron utilizar esta información en combinación con datos publicados anteriormente para construir una red de transducción de señales para las proteínas aguas abajo del receptor EphB2.
Otro estudio fosfoproteómico reciente incluyó la identificación y cuantificación a gran escala de los eventos de fosforilación desencadenados por la hormona antidiurética vasopresina en el conducto colector del riñón. [9] Se identificaron un total de 714 sitios de fosforilación en 223 fosfoproteínas únicas, incluidos tres nuevos sitios de fosforilación en el canal de agua sensible a la vasopresina acuaporina-2 (AQP2).
Investigación sobre el cáncer
Desde el inicio de la fosfoproteómica, la investigación del cáncer se ha centrado en los cambios en el fosfoproteoma durante el desarrollo del tumor . Las fosfoproteínas podrían ser marcadores de cáncer útiles para el diagnóstico y la terapéutica del cáncer. De hecho, la investigación ha demostrado que existen distintos proteomas de fosfotirosina de tumores de mama e hígado. También hay evidencia de hiperfosforilación en residuos de tirosina en tumores de mama pero no en tejidos normales. Hallazgos como estos sugieren que es posible extraer el fosfoproteoma del tumor en busca de biomarcadores potenciales .
Hay disponibles cantidades cada vez mayores de datos que sugieren que existen fosfoproteínas distintivas en varios tumores y que el perfil de fosforilación podría usarse para identificar cánceres de diferentes orígenes. Además, la catalogación sistemática de fosfoproteínas específicas de tumores en pacientes individuales podría revelar múltiples agentes causantes durante la formación del cáncer. Al correlacionar estos datos experimentales con datos clínicos como la respuesta al fármaco y el resultado de la enfermedad, se podrían identificar posibles marcadores de cáncer para el diagnóstico, pronóstico, predicción de la respuesta al fármaco y posibles dianas farmacológicas. [3]
Limitaciones
Si bien la fosfoproteómica ha ampliado enormemente el conocimiento sobre la cantidad y los tipos de fosfoproteínas, junto con su papel en las redes de señalización, todavía existen varias limitaciones para estas técnicas. Para empezar, los métodos de aislamiento como los anticuerpos anti-fosfotirosina no distinguen entre el aislamiento de proteínas fosforiladas en tirosina y proteínas asociadas con proteínas fosforiladas en tirosina. Por lo tanto, aunque las interacciones proteína-proteína dependientes de la fosforilación son muy importantes, es importante recordar que una proteína detectada por este método no es necesariamente un sustrato directo de ninguna tirosina quinasa. Solo mediante la digestión de las muestras antes de la inmunoprecipitación se puede producir el aislamiento de solo las fosfoproteínas y los perfiles temporales de los sitios de fosforilación individuales. Otra limitación es que es probable que se pasen por alto algunas proteínas relevantes, ya que ninguna condición de extracción lo abarca todo. Es posible que se pierdan proteínas con baja estequiometría de fosforilación, en muy baja abundancia, o fosforiladas como diana para una rápida degradación. [10] Los análisis bioinformáticos de los datos de fosforilación de bajo rendimiento junto con los datos de fosfoproteómica de alto rendimiento (basados principalmente en MS / MS) estiman que los protocolos actuales de alto rendimiento, después de varias repeticiones, son capaces de capturar del 70% al 95% de las fosfoproteínas totales, pero solo del 40% al 60% de los sitios de fosforilación totales. [2]
Ver también
Referencias
- ↑ Cohen, Philip (1 de mayo de 2002). "Los orígenes de la fosforilación de proteínas". Biología celular de la naturaleza . 4 (5): E127–130. doi : 10.1038 / ncb0502-e127 . ISSN 1465-7392 . PMID 11988757 .
- ^ a b c Vlastaridis, Panayotis; Kyriakidou, Pelagia; Chaliotis, Anargyros; Van de Peer, Yves; Oliver, Stephen G .; Amoutzias, Grigoris D. (1 de febrero de 2017). "Estimación del número total de fosfoproteínas y sitios de fosforilación en proteomas eucariotas" . GigaScience . 6 (2): 1–11. doi : 10.1093 / gigascience / giw015 . ISSN 2047-217X . PMC 5466708 . PMID 28327990 .
- ^ a b Lim, Y. (2005). "Extracción del fosfoproteoma tumoral de marcadores de cáncer" . Clin Cancer Res . 11 (9): 3163–3169. doi : 10.1158 / 1078-0432.CCR-04-2243 . PMID 15867208 .
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- ^ Kalume, D .; Molina, H; Pandey, A (2003). "Abordar el fosfoproteoma: herramientas y estrategias". Opinión actual en biología química . 7 (1): 64–69. doi : 10.1016 / S1367-5931 (02) 00009-1 . PMID 12547428 .
- ^ Schmelzle, K .; White, F. (2006). "Enfoques fosfoproteómicos para dilucidar las redes de señalización celular". Opinión actual en biología química . 17 (4): 406–414. doi : 10.1016 / j.copbio.2006.06.004 .
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- ^ Zhang; Spellman, DS; Skolnik, EY; Neubert, TA (2006). "Proteómica cuantitativa de fosfotirosina de señalización de EphB2 por marcaje de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular (SILAC)" . J. Proteome Res . 5 (3): 581–8. doi : 10.1021 / pr050362b . PMC 2542903 . PMID 16512673 .
- ^ Hoffert, JD; Pisitkun, Trairak; Wang, Guanghui; Shen, Rong-Fong; Knepper, MA (2006). "Fosfoproteómica cuantitativa de las células renales sensibles a la vasopresina: regulación de la fosforilación de acuaporina-2 en dos sitios" . Proc Natl Acad Sci USA . 103 (18): 7159–64. doi : 10.1073 / pnas.0600895103 . PMC 1459033 . PMID 16641100 .
- ^ Johnson, S; Hunter, T. (2004). "La fosfoproteómica encuentra su momento". Biotecnología de la naturaleza . 22 (9): 1093–1094. doi : 10.1038 / nbt0904-1093 . PMID 15340474 .
enlaces externos
- Base de datos del sitio de fosforilación de fosforilación
- Análisis de video de YouTube de transducción de señal
- Base de datos de fosfoproteínas del conducto colector de CDPD