El virus Y de la papa (PVY) es un virus fitopatógeno de la familia Potyviridae y uno de los virus vegetales más importantes que afectan la producción de papa .
Virus de la papa Y | |
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Clasificación de virus ![]() | |
(no clasificado): | Virus |
Reino : | Riboviria |
Reino: | Orthornavirae |
Filo: | Pisuviricota |
Clase: | Stelpaviricetes |
Pedido: | Patatavirales |
Familia: | Potyviridae |
Género: | Potyvirus |
Especies: | Virus de la papa Y |
Sinónimos | |
virus del mosaico de la berenjena virus |
La infección por PVY de las plantas de papa da como resultado una variedad de síntomas dependiendo de la cepa viral . El más leve de estos síntomas es la pérdida de producción, pero el más perjudicial es la "enfermedad de la mancha anular necrótica del tubérculo de la papa" (PTNRD). Las manchas anulares necróticas hacen que las patatas no sean comercializables y, por lo tanto, pueden provocar una pérdida significativa de ingresos. El PVY es transmisible por los áfidos vectores, pero también puede permanecer inactivo en las semillas de papa. Esto significa que el uso de la misma línea de papa para la producción de semilla de papa durante varias generaciones consecutivas conducirá a un aumento progresivo de la carga viral y la consiguiente pérdida de cosecha .
El aumento de la infección por virus en las plantas de papa durante los últimos años ha provocado pérdidas considerables para la industria sudafricana de la papa. El aumento de la tasa de infección puede atribuirse a varios factores. Estos incluyen una marcada disminución en la eficacia y administración de los productos químicos utilizados en el control de vectores, el uso de semillas de papa infectadas en el cultivo, métodos de riego y de cultivo incorrectos, así como la falta de un método de detección sensible, rápido y confiable. [1] Un aumento en la temperatura promedio de los inviernos como consecuencia del calentamiento global también ha llevado a un aumento en el número de áfidos, lo que a su vez ha llevado a un aumento en la distribución viral. [1] [ cita requerida ]
Huéspedes , cepas y síntomas del virus Y de la papa
PVY pertenece al género Potyvirus , el género más grande de virus de plantas y posiblemente el más destructivo en los cultivos de papa. [2] El género incluye más de 200 especies que provocan pérdidas significativas en el ámbito agrícola. [3] PVY infecta muchas especies de plantas económicamente importantes. Estos incluyen papa ( Solanum tuberosum ), tabaco ( Nicotiana tabacum ), tomate ( Solanum lycopersicum ) y pimiento ( Capsicum spp.). [4] El nivel de daño al cultivo está determinado por la cepa de PVY que infecta las plantas, la carga viral, el momento en que ocurre la infección y la tolerancia que el huésped posee hacia el virus. [5] La resistencia de los hospedadores a la infección por PVY es baja en muchos casos. La infección de un campo de papa con PVY puede resultar en una pérdida de rendimiento del 10-100%. [5]
Se ha demostrado que el PVY tiene diferentes aislados según los síntomas que inducen en diversas especies de plantas de papa. [6] La amplia variabilidad biológica, serológica y molecular de los aislamientos de PVY hace que la clasificación de los aislamientos como cepas particulares sea particularmente difícil. La aparición de una variedad de síntomas y la aparición del PVY NTN necrótico ha llevado a la búsqueda de herramientas de clasificación más fiables que la simple identificación serológica. Tradicionalmente se reconocen tres cepas principales de PVY: PVY C , PVY N y PVY O . PVY C , originalmente conocido como Potato Virus C , fue el primero en ser reconocido y fue identificado en la década de 1930. [7] PVY C induce respuestas hipersensibles en una amplia gama de cultivares de papa. Estas reacciones incluyen la formación de patrones de mosaico leves o rayas punteadas. A diferencia de las otras cepas de PVY, algunas cepas de PVY C no son transmisibles por pulgones. [8] Estudios previos de Visser et al. [9] no identificó ninguno de los aislamientos locales como PVY C, pero se ha informado que ocurre en Sudáfrica. [10] [11] Una segunda cepa de PVY es PVY N . [12] Esta cepa se describió en plantas de tabaco que crecen cerca de las plantas de papa. [13] PVY N produce necrosis foliar y daño leve o incluso nulo a los tubérculos. La cepa ordinaria de PVY se denota como PVY O . La infección de una planta de papa con la cepa PVY O da como resultado un daño leve al tubérculo y no causa necrosis foliar. [14] Tanto el PVY N como el PVY O son transmisibles por pulgones y se encuentran en Sudáfrica. En Europa, se ha demostrado que estas dos cepas se han recombinado para formar PVY NTN . [15] [16] El PVY NTN ha sido acreditado con la capacidad de inducir la enfermedad de la mancha anular necrótica del tubérculo de la papa (PTNRD). [15] Los tubérculos dañados por PTNRD se vuelven no comercializables y la infección por PVY NTN da lugar a un impacto económico mayor que la infección por otras cepas.
Transmisión del virus Y de la papa
El PVY puede transmitirse a las plantas de papa mediante injertos , inoculación de savia de plantas y mediante la transmisión de pulgones . La forma más común de infección por PVY de material vegetal en el campo es a través del pulgón, y aunque los pulgones por sí solos pueden dañar directamente las plantas de papa, es su papel como vectores virales el que tiene el mayor impacto económico. [17] [18] [19] En climas fríos, los pulgones pasan el invierno como pulgones sin alas dando a luz a crías vivas (vivíparas) o como huevos. Huéspedes como las malezas y otros cultivos sirven como caldo de cultivo para estos pulgones y forman un área temporal de colonización antes de que los pulgones migren a los campos de papa. [18] En climas moderados, como en Sudáfrica, se cree que los pulgones se reproducen asexualmente en malezas, otros cultivos, plantas autóctonas y plantas de jardín. Esto significa que hay varios pulgones presentes durante todo el año. En una revisión de Radcliffe y Ragsdale (2002) se enfatiza la importancia de un monitoreo riguroso y efectivo de las poblaciones de áfidos, ya que los viriones PVY se introducen en los campos de papa casi exclusivamente por pulgones alados de una fuente de virus fuera de estos campos. Los pulgones sin alas aún no se han relacionado con la propagación del PVY en los campos de papa. [20]
Se ha descubierto que el pulgón verde del melocotón ( Myzus persicae ) es más eficaz en su papel como vector viral, [5] [17] [21] pero otros como Aphis fabae , Aphis gossypii , Aphis nasturtii , Macrosiphum euphorbiae , Myzus (Nectarosiphon ) certus , Myzus (Phorodon) humuli y Rhopalosiphum insertum también están fuertemente asociados con la transmisión viral. [17] [21] El Consejo de Investigación Agrícola-Instituto de Plantas Ornamentales y Vegetales (ARC-VOPI) 6 de Sudáfrica identificó veinticinco especies de pulgón capaces de funcionar como vectores PVY. [22] También se establecieron las eficiencias de algunos de estos pulgones para funcionar como vectores PVY (Ragsdale et al., 2001) y se encontró que varían entre las diferentes especies. En Sudáfrica, Aphis fabae , Aphis gossypii y Aphis nasturtii son los vectores PVY más comunes y eficientes que se encuentran en el campo. [5] Además de clasificarse según su eficiencia como vectores, los pulgones también se pueden dividir en dos subgrupos, a saber, especies colonizadoras y no colonizadoras. Los pulgones colonizadores son pulgones que se reproducen y se establecen en las plantas de papa, específicamente, mientras que los pulgones no colonizadores no se reproducen ni establecen colonias en las plantas de papa. Los pulgones colonizadores se adaptan mejor a la vida en las plantas de papa y, por lo tanto, generalmente se consideran mejores vectores PVY que los pulgones no colonizadores. Los pulgones no colonizantes no se alimentan principalmente de plantas de papa, pero ocasionalmente se alimentan de ellas mientras buscan un hospedador más adecuado. Su menor eficiencia como vector PVY se anula por el gran número en que ocurren. [19] [23] Debido a esto, todos los pulgones presentes en y alrededor de los campos de papa deben ser considerados como posibles vectores y su número debe ser monitoreado cuidadosamente.
La transmisión del PVY por los pulgones se produce de forma no persistente y no circulativa, lo que sugiere una interacción menos íntima entre el virión y el vector que en el caso de los viriones circulantes. [24] El hecho de que los viriones se transmitan de forma no persistente significa que la replicación viral no ocurre dentro del pulgón vector y que, a menos que el pulgón se alimente de plantas infectadas, pierde su capacidad de infectar plantas después de dos o tres alimentaciones. . [5] [25] Los viriones se adhieren al estilete del pulgón en cuestión de segundos y pueden permanecer infecciosos durante cuatro a diecisiete horas. [26] [27] La distancia a la que se pueden transmitir los viriones es limitada debido al breve período durante el cual permanecen infecciosos. [23] Aunque la corta vida útil fuera de las plantas inhibe la transmisión viral a larga distancia, no reduce la eficiencia de transmisión otorgada por la rápida tasa de adquisición e inoculación viral dentro de un campo.
Al entrar en la célula vegetal, la proteína de la cubierta del virus se desmonta y libera su genoma de ARN . El ARN viral sirve como ARNm y, aunque se sabe poco acerca de la traducción del mismo, se cree que la región no codificante 5 'funciona como un potenciador de la traducción. [28] El ARNm traducido da como resultado una poliproteína que se procesa en proteínas maduras. A continuación, cada poliproteína se escinde en diez proteínas diferentes que se cree que son multifuncionales. Estas proteínas, junto con las proteínas del huésped, se ensamblan para formar un complejo de replicación. Este complejo realiza la síntesis de ARN de cadena negativa, utilizando la cadena positiva de ARN viral como plantilla. Una vez que se han producido las copias de ARN adicionales, codifican la síntesis de varias proteínas, como se mencionó anteriormente, así como las proteínas de la cubierta. Estas proteínas de la cubierta ahora encerrarán los genomas recién formados para dar lugar a nuevos viriones . Se ha sugerido que el recinto de los viriones recién formados se inicia por la interacción de las proteínas de la cubierta con el extremo 5 'y que la proteína de la cubierta se acumula hacia el extremo 3'. [29] Todo el proceso de replicación viral ocurre dentro del retículo endoplásmico . Estas partículas virales recién sintetizadas se transportan posteriormente a través de los plasmodesmos a las células vegetales adyacentes a través de varias proteínas de potyvirus auxiliares. La distribución de virus dentro de la planta ocurre de acuerdo con la relación fuente-sumidero entre los tejidos en maduración y en crecimiento. [30] La concentración de virus en toda la planta es alta y esto aumenta en gran medida la posibilidad de que los pulgones lo absorban. La infección de plantas por potyvirus puede variar en los síntomas mostrados. La infección puede incluir necrosis veinal, síntomas de mosaico y malformación de la hoja (Boonham et al., 2002). Las plantas infectadas que no muestran síntomas pueden tener copas infectadas y producirán productos de menor calidad que sus contrapartes saludables.
Patata - interacción PVY NTN
Dado que PVY NTN causa una gran pérdida en la producción de papa, la investigación de la interacción papa-virus de la papa Y NTN es importante. Los cultivares de papa sensibles responden a la inoculación de PVY NTN con el desarrollo de síntomas típicos. En las hojas inoculadas 5 a 7 días después de la inoculación se desarrollan manchas anulares cloróticas y necróticas. A medida que el virus se propaga por la planta, los síntomas sistémicos se desarrollan en las hojas no inoculadas. 10 días después de la inoculación aparecen las arrugas y la clorosis en mosaico, dando lugar a una apariencia de palmera (caída de la hoja).
Los mecanismos de defensa viral de las plantas intentarán principalmente restringir el movimiento del virus. Si no lo hace, puede intentar inducir la muerte celular en el tejido infectado, evitando así la propagación de viriones. [31] Aunque se desconoce el mecanismo preciso de inducción de enfermedades por potyvirus en plantas, se sabe que estos virus provocan una interrupción significativa de la expresión de genes del hospedador durante la replicación viral. [32] [33] [34]
Se estudiaron intensivamente los cambios fisiológicos en las plantas de papa como respuesta a la infección por PVY NTN . En las primeras etapas de la infección, es decir, las primeras 12 horas, se demostró que los genes relacionados con la fotosíntesis, los genes implicados en la percepción, la señalización y la respuesta de defensa se expresan diferencialmente. [34] 24 h después de la inoculación, la cantidad de ácido salicílico aumentó. [35]
Una interrupción en la expresión genética altera la función celular normal de las células, lo que podría ser la causa de los síntomas físicos que muestra la planta. En el momento del desarrollo de los síntomas, la investigación sobre la interacción entre el cultivo de papa susceptible y PVY NTN mostró cambios en el nivel de citoquininas. [36] En hojas inoculadas que mostraban síntomas de modificaciones en la estructura y tamaño del cloroplasto, [37 ] se detectaron niveles más bajos de clorofila y actividad diferencial de peroxidasas solubles y unidas iónicamente [38] .
En las últimas etapas de la infección por PVY NTN , la concentración de proteína total aumentó en el cultivo de papa sensible, mientras que no se observaron cambios tan pronunciados en los cultivares de papa tolerantes y moderadamente tolerantes. [39] Los estudios de expresión genética revelaron cambios en la expresión de genes para proteínas de choque térmico, catalasa, β-1,3-glucanasa y genes involucrados en la fotosíntesis. [33]
Descripción molecular del virus Y de la papa
Los viriones de Potyvirus consisten en estructuras filamentosas no envueltas que tienen una longitud de 680 a 900 nm y una anchura de 11 a 15 nm. [40] Morfológicamente, la cápside de potyvirus consta de aproximadamente 2 000 copias de proteína de la cubierta (CP). [30]
La cápside encapsula una sola hebra de ARN de sentido positivo que tiene una longitud del orden de 10 kb y tiene una región terminal 5 'no traducida (5'-NTR) así como una cola 3'-poli-A . [41] [42] El genoma de sentido positivo contiene un único marco de lectura abierto extendido y actúa directamente como ARNm. El 5'-NTR de 144 nucleótidos es particularmente rico en residuos de adenina y tiene muy pocos residuos de guanina . En lugar de una estructura de caperuza convencional, el 5'NTR está asociado con una proteína ligada al genoma viral ( VPg ) que se dice que actúa como un potenciador de la transcripción. [28]
La secuencia líder en 5 'tiene un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) y elementos reguladores de traducción independientes del casquete (CIRE). [43] El IRES dirige la traducción independiente del casquete a través de un mecanismo similar al utilizado por los eucariotas. [44] El marco de lectura abierto extendido codifica una poliproteína de 350 kDa. Esta poliproteína es procesada proteolíticamente por proteasas virales (NIa, HC-Pro y P1) y se somete a escisión co y postraduccional para producir varias proteínas multifuncionales. Estos incluyen los siguientes: P1 (proteína P1), HCPro (proteína componente auxiliar), P3 (proteína P3), 6K1 (proteína 1 de 6 kDa), CI (inclusión cilíndrica), 6K2 (proteína 2 de 6 kDa), VPg ( Proteína viral ligada al genoma), NIaPro (proteína de inclusión nuclear a, dominio de proteinasa), NIb (proteína de inclusión nuclear b) y CP (proteína de recubrimiento). [30]
Técnicas de diagnóstico para la detección del virus Y de la papa
ELISA
En el pasado, los cultivos se inspeccionaban visualmente para determinar si estaban libres de enfermedades o no. La inspección visual también se utilizó como base para la certificación de semillas. La determinación del estado viral mediante inspección visual es increíblemente difícil ya que los síntomas pueden estar enmascarados o la infección latente. [23] Como resultado, se introdujeron pruebas e inspecciones posteriores a la temporada. Estas pruebas involucraron el cultivo de material previamente cosechado en invernaderos. Las plantas resultantes se inspeccionaron para obtener una estimación más precisa del estado viral. Aunque este método de detección ofrecía cierto grado de seguimiento de la presencia viral, era subjetivo y muy ineficaz. El cribado mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de cultivos y semillas de patatas sustituyó a la inspección visual a principios de la década de 1970. El uso de ELISA ofreció a los laboratorios de diagnóstico de rutina un método rápido, eficaz y sensible de detección de una amplia gama de virus de plantas de papa.
La detección de patógenos mediante ELISA se basa en la interacción entre el antígeno y los anticuerpos específicos y se ha convertido en un medio popular y rentable de detección de rutina. En un ELISA, la fase sólida se puede recubrir con la muestra de interés que contiene el antígeno. [45] La eficacia a la que el antígeno se une a la fase sólida depende de la temperatura, la duración de la exposición y la concentración. [45] Las fases sólidas utilizadas incluyen membranas de nitrocelulosa, papel, vidrio, agarosa y placas de microvaloración de poliestireno o cloruro de polivinilo. Las placas de microtitulación son la fase sólida más utilizada porque son fáciles de manipular, permiten la automatización y el análisis mediante lectores de placas de microtitulación. Un inconveniente de estas placas es que son muy absorbentes y esto aumenta la incidencia de unión no específica de los componentes utilizados en el ELISA. La unión no específica a las placas se reduce mediante el uso de tampones que contienen proteínas como caseína y detergentes no iónicos como Tween 20. Después del recubrimiento, se retira el exceso de muestra y la placa se trata típicamente con una solución que contiene caseína al 1%. Posteriormente a esto, la fase sólida se trata con anticuerpos producidos contra el antígeno de interés. Después de cada paso de incubación, la placa se lava con Tween 20 que contiene PBS. Estos pasos de lavado están destinados a eliminar cualquier componente unido no específicamente. [46] Los componentes ligados no específicamente están ligados menos fuertemente que los ligados específicamente. La detección se logra mediante la adición de un anticuerpo acoplado a enzima o mediante la adición y detección de un anticuerpo biotinilado. En un sistema que usa un anticuerpo acoplado a enzima, la posterior adición de un sustrato apropiado da como resultado la formación de un color proporcional a la cantidad de antígeno. [46] Alternativamente, la placa puede recubrirse con anticuerpo seguido de incubación con la muestra que se va a detectar. Esto, a su vez, puede detectarse como se describió anteriormente y luego se denomina ELISA de sándwich de doble anticuerpo (DAS). Sin embargo, ambos sistemas tienen la desventaja de que el acoplamiento de la enzima al anticuerpo puede dar como resultado un impedimento estérico que, a su vez, puede dar como resultado una pérdida de la función del anticuerpo y / o la enzima. [47] Esto puede superarse mediante el uso de un puente biotina-avidina o biotina-estreptavidina. En este tipo de sistema, la biotina se acopla al anticuerpo. La molécula de biotina no influye en el funcionamiento de los anticuerpos y se detecta fácilmente utilizando avidina o estreptavidina conjugada con una enzima adecuada. La estreptavidina tiene una afinidad extremadamente alta por la biotina, lo que da como resultado un grado de especificidad incluso mayor que un sistema en el que la enzima se acopla directamente al antígeno. Para establecer si el antígeno está presente o no, se agrega un sustrato específico para la enzima utilizada. A continuación, la enzima convierte el sustrato en un producto coloreado y la intensidad del color puede correlacionarse con la cantidad de anticuerpos unidos y, por tanto, con la cantidad de antígeno presente. Un DAS-ELISA tiene la ventaja de que puede aumentar la especificidad del ELISA y reducir la aparición de uniones no específicas. Como resultado, el principio DAS-ELISA se emplea comúnmente en ELISA para la detección de patógenos de plantas en la savia de las plantas sin una purificación previa del patógeno.
El ELISA se considera un método seguro, económico y rápido para la detección de virus de plantas. La naturaleza económica y la relativa simplicidad del mismo permite que se utilice como un caballo de batalla dentro del sector agrícola y se utilice para cribar miles de muestras por año. Desafortunadamente, los ELISA no son completamente a prueba de fallas. Los niveles de virus dentro de los tubérculos de papa, que se analizan mediante ELISA para su uso como semillas de papa, son normalmente bajos mientras los tubérculos están inactivos. La detección ELISA de virus en estas patatas es difícil y los valores de absorbancia pueden caer por debajo del valor de corte establecido. Por esta razón, el cribado de tubérculos-semilla se realiza en tubérculos que brotan en lugar de latentes. Aunque esto da como resultado lecturas más confiables que las pruebas directas de tubérculos, retrasa la certificación de semillas de papa. [48] Otra desventaja de un método de detección basado en inmunología es que los cambios a nivel genético pueden influir en la inmunogenicidad del antígeno que se va a detectar. En términos de virus de plantas de patata, las mutaciones dentro del gen CP pueden hacer que el CP experimente cambios conformacionales haciendo que los anticuerpos producidos contra el virus presente previamente sean menos efectivos.
RT-PCR
La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) se ha convertido en un método poderoso y eficaz para la detección de virus de plantas de papa en el material vegetal de papa e incluso en papas inactivas. Solo se requiere una pequeña pieza de material vegetal para el análisis mediante RT-PCR. Teniendo en cuenta el protocolo descrito en esta tesis, 0,1 g de material vegetal es suficiente para 14 500 reacciones separadas. Durante una RT-PCR, las secuencias de ARN diana específicas se amplifican exponencialmente en copias de ADN. Sin embargo, para que esto suceda, el ARN del virus debe transcribirse primero a ADN por medio de una polimerasa de transcriptasa inversa. Esta polimerasa sintetiza una hebra de ADN utilizando el ARN como molde. Esto da como resultado un complejo de ADN / ARN. Para la síntesis de una hebra de ADN a partir de la plantilla de ARN, solo se requiere el cebador inverso, ya que el ARN es una hebra única dispuesta de 5 'a 3'. Posteriormente, la cadena de ADN recién sintetizada se utiliza como molde para la PCR tradicional.
Se encuentran disponibles diferentes tipos de polimerasas de transcriptasa inversa para adaptarse a diferentes necesidades y condiciones de reacción. Las enzimas de transcriptasa inversa comúnmente utilizadas incluyen AMV RT, SuperScript III, ImProm-II, Omniscript, Sensiscript y Tth RT. Al final del paso de RT, la enzima polimerasa se activa por calor. También podría ser que la polimerasa de la transcriptasa inversa y la polimerasa de ADN sean una y la misma enzima y que la enzima solo requiera un paso de activación de la polimerasa de ADN después del paso de RT. Un ejemplo de tal enzima es la polimerasa Tth. Esta enzima tiene actividad tanto de transcriptasa inversa dependiente de ARN como de polimerasa dependiente de ADN. Sin embargo, el centro activo de la ADN polimerasa está cubierto por oligonucleótidos dedicados , llamados aptámeros . A temperaturas por debajo de la temperatura de reacción óptima, el componente de polimerasa dependiente de ADN de Tth permanece cubierto por los aptámeros. A estas temperaturas, la enzima Tth solo sintetiza una copia de ADN de la plantilla de ARN. Una vez que la temperatura de reacción se eleva a 95 ° C, se eliminan los aptámeros y el componente de polimerasa dependiente de ADN comenzará a amplificar la secuencia diana.
La amplificación por PCR del ADN diana se produce en tres pasos: desnaturalización , hibridación y extensión. [46] Cada uno de estos pasos ocurre a una temperatura específica durante un período de tiempo fijo. Normalmente se permite que la desnaturalización ocurra entre 90 y 95 ° C y conduce a la disociación de las cadenas de ADN. Después de esto, la reacción se enfría entre 40 y 70 ° C para permitir que los cebadores se asocien con sus respectivas secuencias diana. Este paso se conoce como paso de recocido y es específico del cebador. La temperatura a la que se recogen los cebadores es crítica. Temperaturas demasiado altas no permitirían que los cebadores se asocien con el ADN, lo que da como resultado una amplificación pobre o nula. Una temperatura de hibridación demasiado baja conduciría en última instancia a una unión no específica de los cebadores y una amplificación no específica. [46] Los cebadores unidos a las regiones que flanquean el ADN diana proporcionan grupos 3'-hidroxilo para la extensión catalizada por la ADN polimerasa. La ADN polimerasa más utilizada es Taq , una enzima termoestable aislada de la bacteria termófila Thermus aquaticus . La ADN polimerasa sintetiza nuevas cadenas de ADN a lo largo de las cadenas molde, utilizando los cebadores como puntos de partida. Durante el paso de extensión, las hebras se amplifican más allá del ADN diana. Esto significa que cada hebra de ADN recién sintetizada tendrá una región complementaria a un cebador. Hay un aumento exponencial en la cantidad de ADN producido cuando los tres pasos mencionados anteriormente se repiten de forma cíclica. En una PCR tradicional, estos pasos pueden repetirse de 20 a 55 veces. Sin embargo, un problema con la amplificación por PCR es que la temperatura requerida para la disociación de la cadena de ADN también da como resultado la desnaturalización de la ADN polimerasa. Esto se supera parcialmente mediante la bioingeniería de polimerasas que son más estables térmicamente y tienen vidas medias más largas.
Aunque la RT-PCR es técnicamente más difícil de realizar y más cara que ELISA, tiene la capacidad de permitir la detección de cargas virales bajas. Se considera que la RT-PCR es de 102 a 105 veces más sensible que el ELISA tradicional. [49] La RT-PCR también permite la detección de varias dianas virales en la misma reacción mediante el uso de varias combinaciones de cebadores. A esto se le llama multiplexación. Aunque la multiplexación es técnicamente más exigente que una reacción simplex tradicional, permite un mayor rendimiento ya que se puede analizar una sola muestra para detectar varias cepas virales en una sola reacción. Los cebadores utilizados para la multiplexación se eligen de tal manera que dan como resultado amplicones de varios tamaños. Esto permite el análisis posterior a RT-PCR mediante electroforesis en gel. Aunque la RT-PCR ahorra tiempo, permite la multiplexación y es más sensible que ELISA, los reactivos y la instrumentación necesarios son costosos y requieren un mayor nivel de experiencia técnica. Además, el análisis del producto final mediante electroforesis en gel es laborioso, relativamente más caro, requiere mucho tiempo y no se presta a la automatización. Por estas razones, el uso de RT-PCR para el cribado de rutina no es factible y no ha reemplazado al ELISA. Sin embargo, brinda a la industria la oportunidad de seleccionar casos límite, especialmente en el caso de la certificación de semilla de papa.
PCR cuantitativa
En la mayoría de los PCR tradicionales, los productos resultantes se analizan una vez finalizada la PCR. Esto se denomina análisis de punto final y normalmente es de naturaleza cualitativa en lugar de cuantitativo. Para este tipo de análisis, los productos se analizan principalmente en un gel de agarosa y se visualizan utilizando bromuro de etidio como tinte fluorescente . La correlación directa entre la intensidad de la señal y la concentración inicial de la muestra no es posible mediante el análisis de punto final, ya que la eficiencia de la PCR disminuye a medida que la reacción se acerca a la fase de meseta. Sin embargo, la PCR cuantitativa ofrece una alternativa rápida y precisa a la PCR tradicional. La PCR cuantitativa ofrece al investigador la oportunidad de amplificar y analizar el producto en un solo tubo utilizando tintes fluorescentes. Esto se conoce como PCR homogénea. Durante una PCR cuantitativa, el aumento de la fluorescencia se correlaciona con el aumento del producto. Mediante el uso de diferentes tintes específicos, la PCR cuantitativa se puede utilizar para distinguir entre diferentes cepas de un virus e incluso para detectar mutaciones puntuales. La principal ventaja de la PCR cuantitativa es que no se requiere el análisis de los productos resultantes mediante electroforesis en gel. Esto significa que la PCR cuantitativa se puede implementar como una técnica de alto rendimiento para el cribado de muestras.
Se ha descrito la PCR cuantitativa para la detección [50] y discriminación de aislamientos de PVY O y PVY N [51] [52] y para una discriminación confiable entre aislamientos de PVY NTN y PVY N. [53]
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enlaces externos
- ICTVdB - La base de datos universal de virus: virus de la patata Y
- Grupos familiares: el método Baltimore
- Universidad de Stellenbosch - Departamento de Bioquímica