Dentro del campo de la biología molecular , un ensayo de complementación de fragmentos de proteína , o PCA, es un método para la identificación y cuantificación de interacciones proteína-proteína . En el PCA, las proteínas de interés ("cebo" y "presa") están cada una unida covalentemente a fragmentos de una tercera proteína (por ejemplo, DHFR, que actúa como un "informador"). La interacción entre las proteínas del cebo y la presa acerca los fragmentos de la proteína informadora para permitirles formar una proteína informadora funcional cuya actividad puede medirse. Este principio se puede aplicar a muchas proteínas informadoras diferentes y también es la base para el sistema de dos híbridos de levadura , un ensayo de PCA arquetípico.
Ensayos de proteína dividida
Cualquier proteína que pueda dividirse en dos partes y reconstituirse de forma no covalente para formar una proteína funcional puede usarse en un PCA. Sin embargo, los dos fragmentos tienen poca afinidad entre sí y deben unirse mediante otras proteínas que interactúan fusionadas con ellos (a menudo llamados "cebo" y "presa", ya que la proteína cebo se puede utilizar para identificar una proteína de presa, ver figura ). La proteína que produce una lectura detectable se llama "informadora". Normalmente se utilizan como indicadores enzimas que confieren resistencia a la privación de nutrientes o antibióticos, como dihidrofolato reductasa o beta-lactamasa , respectivamente, o proteínas que dan señales colorimétricas o fluorescentes. Cuando se reconstituyen las proteínas fluorescentes, el PCA se denomina ensayo de complementación de fluorescencia bimolecular . Las siguientes proteínas se han utilizado en PCA de proteínas divididas:
- Beta-lactamasa [1] [2]
- Dihidrofolato reductasa (DHFR) [3]
- Quinasa de adhesión focal (FAK) [4]
- Gal4, un factor de transcripción de levadura (como en el sistema clásico de dos híbridos de levadura )
- GFP (split-GFP), por ejemplo, EGFP ( proteína fluorescente verde mejorada ) [5] [6] [7]
- Peroxidasa de rábano picante [8]
- Proteína fluorescente infrarroja IFP1.4, un dominio de unión a cromóforo (CBD) diseñado de un bacteriofitocromo de Deinococcus radiodurans [9]
- LacZ ( beta-galactosidasa ) [10]
- Luciferasa , [11] [12] incluyendo ReBiL (luciferasa bimolecular mejorada por recombinasa) [13] y luciferasa de Gaussia princeps . [14] Los productos comerciales que utilizan luciferasa incluyen NanoLuc y NanoBIT. [15] También se ha desarrollado una modificación para las interacciones asociadas a las gotas de lípidos. [dieciséis]
- TEV ( proteasa del virus del grabado del tabaco ) [17]
- Ubiquitina [18]
Aplicaciones para todo el genoma
Los métodos mencionados anteriormente se han aplicado a genomas completos , por ejemplo, levadura [3] o bacterias de la sífilis . [19]
Referencias
- ^ Park JH, Back JH, Hahm SH, Shim HY, Park MJ, Ko SI, Han YS (octubre de 2007). "La estrategia de complementación de la fragmentación de la beta-lactamasa bacteriana se puede utilizar como un método para identificar pares de proteínas que interactúan". Revista de Microbiología y Biotecnología . 17 (10): 1607-15. PMID 18156775 .
- ^ Remy I, Ghaddar G, Michnick SW (2007). "Utilizando el ensayo de complementación de fragmentos de proteína beta-lactamasa para sondear interacciones dinámicas proteína-proteína". Protocolos de la naturaleza . 2 (9): 2302–6. doi : 10.1038 / nprot.2007.356 . PMID 17853887 .
- ^ a b Tarassov K, Messier V, Landry CR, Radinovic S, Serna Molina MM, Shames I, Malitskaya Y, Vogel J, Bussey H, Michnick SW (junio de 2008). "Un mapa in vivo del interactoma de la proteína de levadura" (PDF) . Ciencia . 320 (5882): 1465–70. Código Bibliográfico : 2008Sci ... 320.1465T . doi : 10.1126 / science.1153878 . PMID 18467557 .
- ^ Ma Y, Nagamune T, Kawahara M (septiembre de 2014). "Cinasa de adhesión focal dividida para sondear interacciones proteína-proteína". Revista de Ingeniería Bioquímica . 90 : 272-278. doi : 10.1016 / j.bej.2014.06.022 .
- ^ Barnard E, Timson DJ (2010). Pantallas de EGFP divididas para la detección y localización de interacciones proteína-proteína en células de levadura vivas . Métodos en Biología Molecular. 638 . págs. 303-17. doi : 10.1007 / 978-1-60761-611-5_23 . ISBN 978-1-60761-610-8. PMID 20238279 .
- ^ Blakeley BD, Chapman AM, McNaughton BR (agosto de 2012). "El reensamblaje de GFP superpositivo dividido es un método rápido, eficiente y robusto para detectar interacciones proteína-proteína in vivo". Biosistemas moleculares . 8 (8): 2036–40. doi : 10.1039 / c2mb25130b . PMID 22692102 .
- ^ Cabantous S, Nguyen HB, Pedelacq JD, Koraïchi F, Chaudhary A, Ganguly K, Lockard MA, Favre G, Terwilliger TC, Waldo GS (octubre de 2013). "Un nuevo sensor de interacción proteína-proteína basado en asociación tripartita split-GFP" . Informes científicos . 3 : 2854. Código Bibliográfico : 2013NatSR ... 3E2854C . doi : 10.1038 / srep02854 . PMC 3790201 . PMID 24092409 .
- ^ Martell JD, Yamagata M, Deerinck TJ, Phan S, Kwa CG, Ellisman MH, Sanes JR, Ting AY (julio de 2016). "Una peroxidasa de rábano picante dividida para la detección de interacciones proteína-proteína intercelulares y visualización sensible de sinapsis" (PDF) . Biotecnología de la naturaleza . 34 (7): 774–80. doi : 10.1038 / nbt.3563 . PMC 4942342 . PMID 27240195 .
- ^ Tchekanda E, Sivanesan D, Michnick SW (junio de 2014). "Un reportero de infrarrojos para detectar la dinámica espacio-temporal de las interacciones proteína-proteína". Métodos de la naturaleza . 11 (6): 641–4. doi : 10.1038 / nmeth.2934 . PMID 24747815 .
- ^ Rossi F, Charlton CA, Blau HM (agosto de 1997). "Seguimiento de interacciones proteína-proteína en células eucariotas intactas mediante complementación con beta-galactosidasa" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 94 (16): 8405–10. Código Bibliográfico : 1997PNAS ... 94.8405R . doi : 10.1073 / pnas.94.16.8405 . PMC 22934 . PMID 9237989 .
- ^ Cassonnet P, Rolloy C, Neveu G, Vidalain PO, Chantier T, Pellet J, Jones L, Muller M, Demeret C, Gaud G, Vuillier F, Lotteau V, Tangy F, Favre M, Jacob Y (noviembre de 2011). "Evaluación comparativa de un ensayo de complementación de luciferasa para la detección de complejos de proteínas". Métodos de la naturaleza . 8 (12): 990–2. doi : 10.1038 / nmeth.1773 . PMID 22127214 .
- ^ Fujikawa, Y. et al. (2014) Ensayo de complementación de luciferasa dividida para detectar interacciones proteína-proteína reguladas en protoplastos de arroz en un formato a gran escala . Arroz 7:11
- ^ Li YC, Rodewald LW, Hoppmann C, Wong ET, Lebreton S, Safar P, Patek M, Wang L, Wertman KF, Wahl GM (diciembre de 2014). "Una plataforma versátil para analizar interacciones proteína-proteína transitorias y de baja afinidad en células vivas en tiempo real" . Informes de celda . 9 (5): 1946–58. doi : 10.1016 / j.celrep.2014.10.058 . PMC 4269221 . PMID 25464845 .
- ^ Neveu G, Cassonnet P, Vidalain PO, Rolloy C, Mendoza J, Jones L, Tangy F, Muller M, Demeret C, Tafforeau L, Lotteau V, Rabourdin-Combe C, Travé G, Dricot A, Hill DE, Vidal M, Favre M, Jacob Y (diciembre de 2012). "Análisis comparativo de interactomas virus-huésped con un ensayo de complementación de proteínas de alto rendimiento de mamíferos basado en luciferasa de Gaussia princeps" . Métodos . 58 (4): 349–59. doi : 10.1016 / j.ymeth.2012.07.029 . PMC 3546263 . PMID 22898364 .
- ^ Binkowski B, Eggers C, Butler B, Schwinn M, Slater M, Machleidt T, Cong M, Wood K, Fan F (mayo de 2016). "Monitoreo de las interacciones de proteínas intracelulares utilizando la tecnología binaria NanoLuc® (NanoBiTTM)" (PDF) . Promega.
- ^ Kolkhof P, Werthebach M, van de Venn A, Poschmann G, Chen L, Welte M, Stühler K, Beller M (marzo de 2017). "Un ensayo de complementación de fragmentos de luciferasa para detectar interacciones proteína-proteína asociadas a gotitas de lípidos" . Proteómica molecular y celular . 16 (3): 329–345. doi : 10.1074 / mcp.M116.061499 . PMC 5340998 . PMID 27956707 .
- ^ Wehr MC, Laage R, Bolz U, Fischer TM, Grünewald S, Scheek S, Bach A, Nave KA, Rossner MJ (diciembre de 2006). "Monitoreo de interacciones proteína-proteína reguladas usando TEV dividido". Métodos de la naturaleza . 3 (12): 985–93. doi : 10.1038 / nmeth967 . PMID 17072307 .
- ^ Dünkler A, Müller J, Johnsson N (2012). Detección de interacciones proteína-proteína con el sensor Split-Ubiquitin . Métodos en Biología Molecular. 786 . págs. 115-30. doi : 10.1007 / 978-1-61779-292-2_7 . ISBN 978-1-61779-291-5. PMID 21938623 .
- ^ Titz, Björn; Rajagopala, Seesandra V .; Goll, Johannes; Häuser, Roman; McKevitt, Matthew T .; Palzkill, Timothy; Uetz, Peter (28 de mayo de 2008). "La proteína binaria interactoma de Treponema pallidum - la espiroqueta de la sífilis" . PLOS ONE . 3 (5): e2292. doi : 10.1371 / journal.pone.0002292 . ISSN 1932-6203 . PMC 2386257 . PMID 18509523 .
Otras lecturas
- Rochette S, Diss G, Filteau M, Leducq JB, Dubé AK, Landry CR (marzo de 2015). "Cribado de interacción proteína-proteína en todo el genoma mediante ensayo de complementación de fragmentos de proteína (PCA) en células vivas" . Revista de experimentos visualizados (97). doi : 10.3791 / 52255 . PMC 4401175 . PMID 25867901 .