El sistema informador GUS ( GUS : β-glucuronidasa ) es un sistema de genes informadores , particularmente útil en biología molecular vegetal [1] y microbiología. [2] Se encuentran disponibles varios tipos de ensayo del gen indicador GUS , según el sustrato utilizado. El término tinción GUS se refiere al más común de ellos, una técnica histoquímica.
Propósito
El propósito de esta técnica es analizar la actividad de un promotor de la transcripción de genes (en términos de expresión de un gen llamado reportero bajo el control regulador de ese promotor) ya sea de manera cuantitativa, que implica alguna medida de actividad, o cualitativamente ( encendido versus apagado) mediante la visualización de su actividad en diferentes células, tejidos u órganos. La técnica utiliza el gen uidA de Escherichia coli , que codifica la enzima β-glucuronidasa ; [3] esta enzima, cuando se incuba con sustratos específicos incoloros o no fluorescentes , puede convertirlos en productos fluorescentes o coloreados estables . [4] La presencia del color inducido por GUS indica dónde se ha expresado activamente el gen. De esta forma, la actividad promotora fuerte produce mucha tinción y la actividad promotora débil produce menos tinción.
El gen uidA también se puede fusionar con un gen de interés, creando una fusión de genes . La inserción del gen uidA provocará la producción de GUS, que luego puede detectarse utilizando varios glucurónidos como sustratos. [4]
Sustratos
Existen diferentes glucurónidos posibles que se pueden utilizar como sustratos para la β-glucuronidasa, dependiendo del tipo de detección necesaria ( histoquímica , espectrofotométrica , fluorimétrica ). El sustrato más común para la tinción histoquímica de GUS es 5-bromo-4-cloro-3-indolil glucurónido ( X-Gluc ). X-Gluc es hidrolizado por GUS en el producto 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-índigo (diX-indigo). DiX-indigo aparecerá azul y se puede ver con microscopía óptica. [5] Este proceso es análogo a la hidrólisis de X-gal por Beta-galactosidasa [5] para producir células azules como se practica comúnmente en ensayos de genes indicadores bacterianos.
Para otros tipos de detección, los sustratos comunes son p-nitrofenil β-D-glucurónido para el ensayo espectrofotométrico y 4-metilumbeliferil-beta-D-glucurónido (MUG) para el ensayo fluorimétrico. [6]
Historia
El sistema fue desarrollado originalmente por Richard Anthony Jefferson durante su Ph.D. en la Universidad de Colorado en Boulder . [7] Adaptó la técnica para el uso con plantas mientras trabajaba en el Plant Breeding Institute de Cambridge , entre 1985 y 1987. [1] Desde entonces, miles de laboratorios han utilizado el sistema, convirtiéndolo en una de las herramientas más utilizadas. en biología molecular vegetal, como lo subrayan miles de citas en la literatura científica. [7]
Organismos objetivo
Un organismo es adecuado para un ensayo de GUS si carece de actividad de β-glucuronidasa de origen natural o si la actividad es muy baja ( actividad de fondo ). Por esta razón, el ensayo no es útil en la mayoría de los vertebrados y muchos moluscos . [6] Dado que no hay actividad GUS detectable en plantas superiores , musgos , algas , helechos , hongos y la mayoría de las bacterias , [6] el ensayo es ideal para estudios de expresión génica en estos organismos, y se considera el gen indicador de elección para en ciencia de las plantas.
Beneficios y limitaciones
El ensayo GUS no requiere la presencia de cofactores o iones para funcionar. La beta-glucuronidasa puede funcionar a través de una amplia gama de valores de pH y es bastante resistente a la inactivación térmica. [8] Sin embargo, GUS es susceptible a la inhibición de ciertos iones de metales pesados, como Cu 2+ y Zn 2+ .
Además, la interpretación del ensayo está limitada por el movimiento de diX-indigo a lo largo de la célula. DiX-indigo, puede asociarse con lípidos para difundirse lejos del sitio de actividad enzimática, lo que muestra una falta de localización citosólica e irregularidad en la penetración del sustrato. Esto puede conducir potencialmente a una interpretación incorrecta de la localización de la proteína GUS. [9] A pesar de la falta de localización celular, se ha observado bien la localización nuclear de GUS. [10] Los ensayos de GUS se pueden realizar en presencia de ferricianuro de potasio para evitar que la mancha se difunda. [5]
Otros sistemas de reporteros
El sistema GUS no es el único sistema informador de genes disponible para el análisis de la actividad promotora. Otros sistemas competidores se basan, por ejemplo , en luciferasa , GFP , beta-galactosidasa , cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), fosfatasa alcalina . El uso de uno u otro sistema depende principalmente del organismo de interés y de las tecnologías de imagen y microscopía de que dispongan los laboratorios que realizan la investigación.
Otros usos
El ensayo GUS, así como otros sistemas de genes indicadores, se pueden utilizar para otros tipos de estudios distintos del ensayo clásico de actividad promotora. Los sistemas informadores se han utilizado para determinar la eficiencia de los sistemas de administración de genes, la localización intracelular de un producto génico, la detección de interacciones proteína-proteína o proteína-ADN, la eficiencia de las señales de iniciación de la traducción y el éxito de los esfuerzos de clonación molecular.
Fuentes
- ^ a b Jefferson, RA ; Kavanagh, TA; Bevan, MW (1987). "Fusiones GUS: Beta-glucuronidasa como un marcador de fusión de genes sensible y versátil en plantas superiores" . El diario EMBO . 6 (13): 3901–7. doi : 10.1002 / j.1460-2075.1987.tb02730.x . PMC 553867 . PMID 3327686 .
- ^ Vande Broek, A; Lambrecht, M; Vanderleyden, J (1998). "La motilidad quimiotáctica bacteriana es importante para el inicio de la colonización de la raíz del trigo por Azospirillum brasilense". Microbiología . 144 (9): 2599–606. doi : 10.1099 / 00221287-144-9-2599 . PMID 9782509 .
- ^ Blanco, C; Ritzenthaler, P; Mata-Gilsinger, M. (1982). "Clonación y análisis de restricción de endonucleasas de genes uidA y uidR en Escherichia coli K-12: determinación de la dirección de transcripción del gen uidA" . Revista de bacteriología . 149 (2): 587–94. doi : 10.1128 / JB.149.2.587-594.1982 . PMC 216546 . PMID 6276362 .
- ^ a b Jefferson, RA; Burgess, SM; Hirsh, D (1986). "Beta-glucuronidasa de Escherichia coli como marcador de fusión de genes" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 83 (22): 8447–51. Código Bibliográfico : 1986PNAS ... 83.8447J . doi : 10.1073 / pnas.83.22.8447 . PMC 386947 . PMID 3534890 .
- ^ a b c Guivarc'h, A .; Caissard, JC; Azmi, A .; Elmayan, T .; Chriqui, D .; Tepfer, M. (1 de septiembre de 1996). "Detección in situ de la expresión del gen reporter thegus en plantas transgénicas: diez años de genes azules" . Investigación transgénica . 5 (5): 281–288. doi : 10.1007 / BF01968938 . ISSN 1573-9368 .
- ^ a b c Patente de EE. UU. 5.268.463
- ^ a b Sitio web de la organización Cambia : biografía de Richard A. Jefferson
- ^ Jefferson, Richard A. (1 de diciembre de 1987). "Ensayo de genes quiméricos en plantas: el sistema de fusión de genes GUS" . Reportero de Biología Molecular Vegetal . 5 (4): 387–405. doi : 10.1007 / BF02667740 . ISSN 1572-9818 .
- ^ Caissard, Jean-Claude; Guivarc'h, Anne; Rembur, Jacques; Azmi, Abdelkrim; Chriqui, Dominique (1 de mayo de 1994). "Ubicaciones espurias de microcristales diX-indigo generados por el ensayo histoquímico GUS" . Investigación transgénica . 3 (3): 176–181. doi : 10.1007 / BF01973985 . ISSN 1573-9368 .
- ^ Citovsky, V .; Zupan, J .; Warnick, D .; Zambryski, P. (26 de junio de 1992). "Localización nuclear de la proteína Agrobacterium VirE2 en células vegetales" . Ciencia . 256 (5065): 1802–1805. doi : 10.1126 / science.1615325 . ISSN 0036-8075 . PMID 1615325 .