El sistema de transposones de la Bella Durmiente es un transposón de ADN sintético diseñado para introducir secuencias de ADN definidas con precisión en los cromosomas de animales vertebrados con el fin de introducir nuevos rasgos y descubrir nuevos genes y sus funciones. Es un sistema de tipo Tc1 / mariner , con la transposasa resucitada de múltiples secuencias de peces inactivos.
Mecanismo de acción
La Bella Durmiente transposón sistema se compone de un Bella Durmiente (SB) transposasa y un transposón que fue diseñado en 1997 para insertar secuencias específicas de ADN en genomas de animales vertebrados. Los transposones de ADN se trasladan de un sitio de ADN a otro de una manera simple de cortar y pegar (Fig. 1). La transposición es un proceso preciso en el que un segmento de ADN definido se escinde de una molécula de ADN y se mueve a otro sitio en la misma o diferente molécula de ADN o genoma . [1]
Como hacen todas las demás transposasas de tipo Tc1 / mariner , la transposasa SB inserta un transposón en un par de bases de dinucleótidos TA en una secuencia de ADN receptora. [2] El sitio de inserción puede estar en otra parte de la misma molécula de ADN o en otra molécula de ADN (o cromosoma). En los genomas de mamíferos, incluidos los humanos, hay aproximadamente 200 millones de sitios TA. El sitio de inserción de TA se duplica en el proceso de integración de transposones. Esta duplicación de la secuencia TA es un sello distintivo de la transposición y se utiliza para determinar el mecanismo en algunos experimentos. Sin embargo, un estudio reciente indicó que SB también se integra en dinucleótidos que no son TA a baja frecuencia. [3] La transposasa puede codificarse dentro del transposón (por ejemplo, el transposón putativo mostrado en la Fig. 2) o la transposasa puede ser suministrada por otra fuente, en cuyo caso el transposón se convierte en un elemento no autónomo. Los transposones no autónomos (p. Ej., Fig. 1) son más útiles como herramientas genéticas porque después de la inserción no pueden continuar escindiendo y reinsertando de forma independiente. Todos los transposones de ADN identificados en el genoma humano y otros genomas de mamíferos no son autónomos porque, aunque contienen genes de transposasa, los genes no son funcionales y no pueden generar una transposasa que pueda movilizar el transposón.
Construcción
Este gen de la transposasa resucitado se denominó " La Bella Durmiente (SB) " porque volvió a la actividad después de un largo sueño evolutivo. [4] El sistema de transposones SB es sintético en el sentido de que la transposasa SB se reconstruyó a partir de secuencias de transposasas extintas (fósiles) pertenecientes a la clase de transposones Tc1 / mariner [5] [6] que se encuentran en los genomas de los salmónidos. [7] Al igual que en los seres humanos, donde unos 20.000 transposones inactivados de Tc1 / tipo marinero comprenden casi el 3% del genoma humano , [8] [9] los genes de transposasa que se encuentran en los peces han estado inactivos durante más de 10 millones de años debido a la acumulación mutaciones. La reconstrucción de la transposasa SB se basó en el concepto de que había un transposón primordial similar a Tc1 que era el antepasado de las secuencias que se encuentran en los genomas de los peces. Aunque había muchas secuencias que parecían transposones Tc-1 en todos los genomas de peces estudiados, todas las secuencias de transposones estaban inactivas debido a mutaciones. Suponiendo que las variaciones en las secuencias se debían a mutaciones independientes que se acumulaban en los diferentes transposones, se postuló un supuesto transposón ancestral (Fig. 2). [10]
La construcción de la transposasa comenzó fusionando porciones de dos secuencias de transposones inactivos del salmón del Atlántico ( Salmo salar ) y una secuencia de transposones inactivos de la trucha arco iris ( Oncorhynchus mykiss ) y luego reparando pequeños déficits en los dominios funcionales de la enzima transposasa (Fig.3 ). Cada aminoácido de la primera transposasa completa, llamada SB10, se determinó mediante una " secuencia de consenso de la regla de la mayoría " basada en 12 genes parciales encontrados en ocho especies de peces. Los primeros pasos (1-> 3 en la Fig. 3) fueron restaurar una proteína completa rellenando los huecos en la secuencia e invirtiendo los codones de terminación que evitarían la sintetización del supuesto polipéptido de 360 aminoácidos. El siguiente paso (4 en la Fig. 3) fue revertir las mutaciones en la señal de localización nuclear (NLS) que se requiere para importar la enzima transposasa desde el citoplasma donde se produce hasta el núcleo donde actúa. El extremo amino de la transposasa, que contiene los motivos de unión al ADN para el reconocimiento de las repeticiones directas (DR), se restauró en los pasos 5-> 8. Los dos últimos pasos restauraron el dominio catalítico, que presenta aminoácidos conservados de ácido aspártico ( D ) y ácido glutámico ( E ) con espaciamiento específico que se encuentran en integrasas y recombinasas . [11] El resultado final fue SB10, que contiene todos los motivos necesarios para la función. [4]
La transposasa SB10 se ha mejorado durante la década desde su construcción aumentando el consenso con un mayor número de secuencias de transposones de Tc1 extintas y probando varias combinaciones de cambios. [12] [13] [14] [15] [16] [17] Otros trabajos han demostrado que el dominio de unión al ADN consta de dos secuencias emparejadas, que son homólogas a los motivos de secuencia que se encuentran en ciertos factores de transcripción. Los subdominios emparejados en la transposasa SB se denominaron PAI y RED. El subdominio PAI juega un papel dominante en el reconocimiento de las secuencias DR en el transposón. El subdominio RED se superpone con la señal de localización nuclear, pero su función sigue sin estar clara. [18] La versión más reciente de SB transposasa, SB100X, tiene aproximadamente 100 veces la actividad de SB10 según lo determinado por ensayos de transposición de genes de resistencia a antibióticos realizados en células HeLa humanas cultivadas en tejido. [16] La Sociedad Internacional de Biología Celular y Molecular y Protocolos e Investigación de Biotecnología (ISMCBBPR) nombró a SB100X como la molécula del año 2009 por reconocer el potencial que tiene en la futura ingeniería del genoma. [19]
El transposón reconocido por la transposasa SB se denominó T porque se aisló del genoma de otro pez salmón, Tanichthys albonubes . El transposón consiste en una secuencia genética de interés que está flanqueada por repeticiones invertidas (IR) que a su vez contienen repeticiones directas cortas (DR) (puntas de flecha en tándem IR-DR en las Figuras 1 y 2). T tenía la secuencia IR / DR más cercana a la secuencia consenso para los transposones extintos similares a Tc-1 en peces. El transposón consenso tiene IR de 231 pares de bases. Los DR más internos tienen una longitud de 29 pares de bases, mientras que los DR más externos tienen una longitud de 31 pares de bases. La diferencia de longitud es fundamental para las velocidades de transposición máximas. [20] El componente del transposón T original del sistema de transposones SB se ha mejorado con cambios menores para ajustarse al consenso de muchos transposones extintos y activos relacionados. [20] [21]
Aplicaciones
Durante la última década, los transposones SB se han desarrollado como vectores no virales para la introducción de genes en genomas de animales vertebrados y para terapia génica . La carga genética puede ser un casete de expresión, un transgén y elementos asociados que confieren regulación transcripcional para la expresión a un nivel deseado en tejido (s) específico (s). Un uso alternativo de los transposones SB es descubrir funciones de genes, especialmente aquellos que causan cáncer , [22] [23] mediante la entrega de secuencias de ADN que interrumpen al máximo la expresión de genes cercanos al sitio de inserción. Este proceso se denomina mutagénesis de inserción o mutagénesis de transposones . Cuando un gen se inactiva mediante la inserción de un transposón (u otro mecanismo), ese gen se "desactiva". Se han fabricado ratones knockout y ratas knockout con el sistema SB. [24] [25] La Figura 4 ilustra estos dos usos de los transposones SB.
Tanto para la entrega de genes como para la alteración de genes, los transposones SB combinan las ventajas de los virus y el ADN desnudo. Los virus se han seleccionado evolutivamente en función de su capacidad para infectar y replicarse en nuevas células huésped. Al mismo tiempo, las células han desarrollado importantes mecanismos de defensa molecular para protegerse contra las infecciones virales. Para algunas aplicaciones de la ingeniería del genoma, como algunas formas de terapia génica, [26] [27] [28] también es importante evitar el uso de virus por razones sociales y regulatorias. El uso de vectores no virales evita muchas, pero no todas, las defensas que las células emplean contra los vectores.
Los plásmidos , los ADN circulares que se muestran en la Fig. 1, se utilizan generalmente para la administración de genes no virales. Sin embargo, existen dos problemas importantes con la mayoría de los métodos para administrar ADN a los cromosomas celulares utilizando plásmidos, la forma más común de administración de genes no virales. En primer lugar, la expresión de transgenes a partir de plásmidos es breve debido a la falta de integración y debido a las respuestas celulares que desactivan la expresión. En segundo lugar, la captación de moléculas de plásmido en las células es difícil e ineficaz. El Sistema de Transposón de la Bella Durmiente fue diseñado para superar el primer problema. Los transposones de ADN insertan con precisión secuencias de ADN definidas (Fig. 1) casi al azar en los genomas del huésped, aumentando así la longevidad de la expresión génica (incluso a través de múltiples generaciones). Además, la transposición evita la formación de múltiples integraciones en tándem, lo que a menudo da como resultado la desactivación de la expresión del transgén. Actualmente, la inserción de transgenes en cromosomas usando plásmidos es mucho menos eficiente que usando virus. Sin embargo, mediante el uso de potentes promotores para regular la expresión de un transgén, el suministro de transposones a unas pocas células puede proporcionar niveles útiles de productos génicos secretados para un animal completo. [29] [30]
Podría decirse que la aplicación potencial más emocionante de los transposones de la Bella Durmiente será la terapia génica humana. La aplicación humana generalizada de la terapia génica en las naciones del primer mundo, así como en los países con economías en desarrollo, se puede imaginar si los costos del sistema de vectores son asequibles. Debido a que el sistema SB está compuesto únicamente de ADN, los costos de producción y entrega se reducen considerablemente en comparación con los vectores virales. Los primeros ensayos clínicos que utilizan transposones SB en células T genéticamente modificadas probarán la eficacia de esta forma de terapia génica en pacientes con riesgo de muerte por neoplasias malignas avanzadas. [31]
Referencias
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