La ADN polimerasa de T7 es una enzima utilizada durante la replicación del ADN del bacteriófago T7 . Durante este proceso, la ADN polimerasa "lee" las cadenas de ADN existentes y crea dos nuevas cadenas que coinciden con las existentes. La ADN polimerasa de T7 requiere un factor huésped, la tiorredoxina de E. coli , [1] para llevar a cabo su función. Esto ayuda a estabilizar la unión de la proteína necesaria a la plantilla del cebador para mejorar la procesividad en más de 100 veces, que es una característica exclusiva de esta enzima. [2] Es un miembro de las ADN polimerasas de la familia A, que incluyen la ADN polimerasa I de E. coli y ADN polimerasa Taq .
ADN polimerasa dirigida por ADN | ||||||
---|---|---|---|---|---|---|
Identificadores | ||||||
Organismo | ||||||
Símbolo | 5 | |||||
número CAS | 9012-90-2 | |||||
UniProt | P00581 | |||||
Otros datos | ||||||
Número CE | 2.7.7.7 | |||||
|
Esta polimerasa tiene varias aplicaciones en mutagénesis dirigida al sitio [3] , así como una enzima de alta fidelidad adecuada para la PCR . [4] También ha servido como precursor de Sequenase, [5] una enzima diseñada optimizada para la secuenciación de ADN . [6]
Mecanismo
Transferencia de fosforilo
Figura 2 . Transferencia de nucleotidilo por ADN polimerasa.
La ADN polimerasa de T7 cataliza la transferencia de fosforilo [7] durante la replicación del ADN del fago T7 . Como se muestra en la Figura 2 , el grupo hidroxilo 3 ' de un cebador actúa como un nucleófilo y ataca el enlace fosfodiéster del nucleósido 5'-trifosfato (dTMP-PP). Esta reacción agrega un monofosfato de nucleósido al ADN y libera un pirofosfato (PPi). Generalmente, la reacción es dependiente de metales y cationes como Mg 2+ a menudo están presentes en el sitio activo de la enzima. [7]
Para la ADN polimerasa T7, los dedos, la palma y el pulgar ( Figura 1 ) colocan la plantilla de cebador de modo que el extremo 3 'de la hebra del cebador se coloque junto al sitio de unión de nucleótidos (ubicado en la intersección de los dedos y el pulgar). ). [8] El par de bases formado entre el nucleótido y la base de la plantilla encaja perfectamente en una ranura entre los dedos y el extremo 3 'del cebador. [8] Dos iones de Mg 2+ forman una red de coordenadas octaédrica con el ligando de oxígeno y también acercan el hidroxilo del cebador reactivo y el nucleótido α-fosfato, lo que reduce el costo entrópico de la adición nucleofílica . [8] El paso que limita la velocidad en el ciclo catalítico ocurre después de que el nucleósido trifosfato se une y antes de que se incorpore al ADN (correspondiente al cierre del subdominio de los dedos alrededor del ADN y el nucleótido). [8]
Papel de los iones de Mg 2+ y los residuos de aminoácidos en el sitio activo
Los aminoácidos presentes en el sitio activo ayudan a crear un entorno estabilizador para que prosiga la reacción. Los aminoácidos como Lys522 , Tyr526 , His506 y Arg518 actúan como donantes de enlaces de hidrógeno . El carbonilo de la cadena principal de Ala476 , Asp475 y Asp654 forman enlaces coordinados con los iones Mg 2+ .
Asp475 y Asp654 forman un puente con los cationes Mg 2+ para orientarlos correctamente. El ion Mg 2+ a la derecha ( Figura 3 ) interactúa con oxígenos cargados negativamente de los fosfatos alfa (α), beta (β) y gamma (γ) para alinear el enlace escindible para que el cebador ataque. [8] Incluso si no hay una base general dentro del sitio activo para desprotonar el hidroxilo cebador, el pka reducido del hidroxilo unido al metal favorece la formación del nucleófilo hidróxido 3 '. [8] Los iones metálicos y Lys522 entran en contacto con oxígenos no puente en el α-fosfato para estabilizar la carga negativa que se desarrolla en el α-fósforo durante la formación de enlaces con el nucleófilo.
Además, la cadena lateral Lys522 también se mueve para neutralizar el grupo pirofosfato cargado negativamente. Las cadenas laterales de Tyr526, His506, Arg518 y el oxígeno del grupo carbonilo de la cadena principal de Ala476 participan en la red de enlaces de hidrógeno y ayudan a alinear el sustrato para la transferencia de fosforilo. [8]
Proteínas accesorias
Mientras que el fago T7 media la replicación del ADN de una manera muy similar a los organismos superiores, el sistema T7 es generalmente más simple en comparación con otros sistemas de replicación. Además de la ADN polimerasa de T7 (también conocida como gp5), el replisoma de T7 requiere solo cuatro proteínas accesorias para su funcionamiento adecuado: tiorredoxina del huésped, gp4, gp2.5 y gp1.7.
Anfitrión tiorredoxina
La polimerasa T7 por sí misma tiene una procesividad muy baja . Se disocia de la plantilla del cebador después de incorporar unos 15 nucleótidos. Tras la infección del huésped, la polimerasa T7 se une a la tiorredoxina del huésped en una proporción de 1: 1. La interacción hidrófoba entre la tiorredoxina y la polimerasa T7 ayuda a estabilizar la unión de la polimerasa T7 a la plantilla del cebador . Además, la unión de tiorredoxina aumenta la procesividad de la polimerasa T7 a casi 80 veces. [9] Aún se desconoce el mecanismo preciso de cómo el complejo tiorredoxina-T7 polimerasa puede lograr tal aumento en la procesividad. La unión de tiorredoxina expone un gran número de residuos de aminoácidos básicos en la región del pulgar de la polimerasa T7. Varios estudios sugieren que la interacción electrostática entre estos residuos básicos cargados positivamente con la cadena principal de fosfato cargada negativamente del ADN y otras proteínas accesorias es responsable del aumento de la procesividad en el complejo gp5 / tiorredoxina. [9] [10] [11]
gp4
gp4 es una proteína hexamérica que contiene dos dominios funcionales: dominio helicasa y dominio primasa . El dominio helicasa desenrolla el ADN de doble hebra para proporcionar un molde para la replicación. La cola C-terminal del dominio helicasa contiene varios residuos ácidos cargados negativamente que entran en contacto con el residuo básico expuesto de la polimerasa T7 / tiorredoxina. Estas interacciones ayudan a cargar el complejo T7 polimerasa / tiorredoxina en la horquilla de replicación . El dominio primasa cataliza la síntesis de oligoribonucleótidos cortos . Estos oligoribonucleótidos, llamados cebadores , son complementarios a la hebra molde y se utilizan para iniciar la replicación del ADN . En el sistema T7, el dominio de primasa de una subunidad interactúa con el dominio de primasa de la subunidad adyacente. Esta interacción entre los dominios de primasa actúa como un freno para detener la helicasa cuando sea necesario, lo que asegura la síntesis del soporte líder al mismo ritmo que la síntesis del soporte rezagado . [11]
gp2.5
Proteína de unión a ADN monocatenario | ||||||
---|---|---|---|---|---|---|
Identificadores | ||||||
Organismo | ||||||
Símbolo | 2.5 | |||||
UniProt | P03696 | |||||
|
gp2.5 tiene una función similar a la proteína de unión a ADN monocatenario . gp2.5 protege el ADN monocatenario producido durante la replicación y coordina la síntesis de las cadenas principales y rezagadas mediante la interacción entre su cola C-terminal ácida y gp5 / tiorredoxina. [11]
gp1.7
Quinasa de nucleótido | ||||||
---|---|---|---|---|---|---|
Identificadores | ||||||
Organismo | ||||||
Símbolo | 1,7 | |||||
UniProt | P03781 | |||||
|
gp1.7 es un nucleósido monofosfato quinasa, que cataliza la conversión de desoxinucleósido 5'-monofosfatos en nucleótidos di y trifosfato, lo que explica la sensibilidad de la polimerasa T7 a los didesoxinucleótidos (ver Sequenasa más adelante). [11]
Propiedades
Procesividad
La subunidad primaria gp5 de la ADN polimerasa T7 por sí misma tiene una baja procesividad y se disocia del ADN después de la incorporación de unos pocos nucleótidos. Para volverse eficientemente procesadora, la ADN polimerasa de T7 recluta tiorredoxina huésped para formar un complejo tiorredoxina-gp5. La tiorredoxina se une al dominio de unión a tiorredoxina de gp5, por lo que estabiliza una región de unión al ADN flexible de gp5. La estabilización de esta región de gp5 aumenta alostéricamente la cantidad de interacción de la superficie de la proteína con la porción dúplex del cebador-molde. El complejo de tiorredoxina-gp5 resultante aumenta la afinidad de la polimerasa T7 por el extremo del cebador en aproximadamente 80 veces y actúa de manera procesiva alrededor de las etapas de incorporación de 800 nucleótidos. [12]
El mecanismo adoptado por la polimerasa T7 para lograr su procesividad se diferencia de muchas otras polimerasas en que no depende de una pinza de ADN o de un cargador de pinzas. En cambio, el complejo de ADN polimerasa de T7 requiere solo tres proteínas para la polimerización de ADN procesiva: polimerasa de T7 (gp5), tiorredoxina de Escherichia coli y proteína de unión a ADN monocatenario gp2.5. [13] Aunque estas tres proteínas son las únicas necesarias para la polimerización de ADN monocatenario molde, en un entorno biológico nativo la tiorredoxina-gp5 interactúa con la helicasa gp4, que proporciona molde de ADN monocatenario (figura 4). Durante la síntesis de la cadena principal, la tiorredoxina-gp5 y la gp4 forman un complejo de alta afinidad que aumenta la procesividad general de la polimerasa a alrededor de 5 kb. [14] [15]
Actividad exonucleasa
La ADN polimerasa de T7 posee una actividad exonucleasa de ADN de cadena sencilla y doble de 3'-5 ' . Esta actividad exonucleasa se activa cuando una base recién sintetizada no se empareja correctamente con la hebra molde. La escisión de bases incorporadas incorrectamente actúa como un mecanismo de corrección de pruebas aumentando así la fidelidad de la polimerasa T7. [4] Durante la caracterización inicial de la actividad exonucleasa, se descubrió que la oxidación catalizada por hierro de la polimerasa T7 producía una enzima modificada con una actividad exonucleasa muy reducida. Este descubrimiento condujo al desarrollo y uso de T7 polimerasa como Sequenase en métodos de secuenciación de ADN temprano. [dieciséis]
El mecanismo por el cual la ADN polimerasa de T7 detecta que se ha incorporado una base no coincidente es todavía un tema de estudio. Sin embargo, algunos estudios han proporcionado evidencia que sugiere que los cambios en la tensión de la hebra de ADN molde causados por el desajuste de pares de bases pueden inducir la activación de exonucleasas. Wuite y col. observaron que la aplicación de una tensión superior a 40 pN al ADN molde dio como resultado un aumento de 100 veces en la actividad exonucleasa. [17]
Aplicaciones
Extensiones de cadena en mutagénesis dirigida al sitio
La mutagénesis dirigida al sitio es un método de biología molecular que se utiliza para realizar cambios específicos e intencionales en la secuencia de ADN de un gen y cualquier producto génico . La técnica se desarrolló en un momento en que la ADN polimerasa de mayor calidad disponible comercialmente para convertir un oligonucleótido en una cadena completa de ADN complementario era el fragmento grande (Klenow) de la ADN polimerasa 1 de E. coli. mutagénesis. Es decir, cuando la ADN ligasa funciona de manera ineficaz en relación con la ADN polimerasa, el desplazamiento de la hebra del oligonucleótido puede reducir la frecuencia mutante. Por otro lado, la ADN polimerasa de T7 no realiza la síntesis de desplazamiento de cadena; y por tanto, se puede utilizar para obtener altas frecuencias de mutantes para mutantes puntuales independientemente de la ligación. [18]
Síntesis de la segunda hebra de ADNc
La clonación de ADNc es una tecnología importante para el análisis de la expresión de genomas. La primera hebra de longitud completa se puede sintetizar mediante las transcriptasas inversas disponibles comercialmente. La síntesis de la segunda hebra fue una vez una limitación importante para la clonación de ADNc. Se desarrollaron dos grupos de métodos que difieren en el mecanismo de iniciación para sintetizar la segunda hebra. En un primer grupo de métodos, el inicio de la síntesis de la segunda hebra tiene lugar dentro de la secuencia de la primera hebra. Sin embargo, se requiere la digestión del extremo 3 'de la primera hebra y, por lo tanto, resulta en la pérdida de las secuencias correspondientes al extremo 5' del ARNm. En un segundo grupo de métodos, el inicio de la síntesis de la segunda hebra tiene lugar fuera de la secuencia de la primera hebra. Este grupo de métodos no requiere la digestión del extremo 3 'de la primera hebra. Sin embargo, la limitación de este grupo de métodos radica en el alargamiento. La clonación con la ADN polimerasa de T7 ayuda a superar esta limitación al permitir la digestión del tracto poli (dT) durante la reacción de síntesis de la segunda cadena. Por lo tanto, no se requiere que el tamaño del tracto sintetizado con transferasa terminal esté dentro de un rango de tamaño dado y los clones resultantes contienen un tramo de un tamaño limitado. Además, debido a la alta actividad exonucleasa 3 'de la ADN polimerasa de T7, se puede obtener un alto rendimiento de la segunda hebra de longitud completa. [19]
Sequenasa (secuenciación de ADN)
En la secuenciación de Sanger , uno de los principales problemas relacionados con las ADN polimerasas es la discriminación frente a los didesoxinucleótidos, los nucleótidos que terminan la cadena. La mayoría de las ADN polimerasas conocidas discriminan fuertemente contra ddNTP; y por tanto, debe usarse una alta relación de ddNTP a dNTP para una terminación de cadena eficiente. La ADN polimerasa de T7 discrimina contra ddNTP solo varias veces; y por tanto, requiere una concentración mucho menor de ddNTP para proporcionar una alta uniformidad de las bandas de ADN en el gel. Sin embargo, su fuerte actividad de exonucleasa 3'-5 'puede interrumpir la secuenciación ya que cuando la concentración de dNTP cae, la actividad de exonucleasa aumenta dando como resultado una síntesis neta de ADN o una degradación del ADN. Para su uso en la secuenciación de ADN, la ADN polimerasa de T7 se ha modificado para eliminar su actividad exonucleasa, ya sea químicamente (Sequenase 1.0) o por eliminación de residuos (Sequenase Versión 2.0). [4] [20]
Referencias
- ^ Mark DF, Richardson CC (marzo de 1976). "Tiorredoxina de Escherichia coli: una subunidad de la ADN polimerasa del bacteriófago T7" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 73 (3): 780–4. Código Bibliográfico : 1976PNAS ... 73..780M . doi : 10.1073 / pnas.73.3.780 . PMC 336002 . PMID 768986 .
- ^ Tabor S, Huber HE, Richardson CC (noviembre de 1987). "La tiorredoxina de Escherichia coli confiere procesividad a la actividad de la ADN polimerasa de la proteína del gen 5 del bacteriófago T7". La revista de química biológica . 262 (33): 16212–23. PMID 3316214 .
- ^ Venkitaraman AR (abril de 1989). "Uso de ADN polimerasa de T7 modificada (sequenasa versión 2.0) para mutagénesis dirigida al sitio de oligonucleótidos" . Investigación de ácidos nucleicos . 17 (8): 3314. doi : 10.1093 / nar / 17.8.3314 . PMC 317753 . PMID 2726477 .
- ^ a b c Zhu B (16 de abril de 2014). "Bacteriófago T7 ADN polimerasa - Secuenasa" . Fronteras en microbiología . 5 : 181. doi : 10.3389 / fmicb.2014.00181 . PMC 3997047 . PMID 24795710 .
- ^ "Thermo Sequenase ADN polimerasa" .
- ^ Voet D, Voet JG (2011). Bioquímica (4ª ed.). Hoboken, Nueva Jersey: John Wiley & Sons. ISBN 9780470917459.
- ^ a b Fersht, Alan (1985). Estructura y mecanismo de la enzima (2ª ed.). Nueva York: WH Freeman. ISBN 9780716716143.
- ^ a b c d e f g Doublié S, Ellenberger T (diciembre de 1998). "El mecanismo de acción de la ADN polimerasa T7" . Opinión actual en biología estructural . 8 (6): 704–12. doi : 10.1016 / s0959-440x (98) 80089-4 . PMID 9914251 .
- ^ a b Bedford E, Tabor S, Richardson CC (enero de 1997). "El dominio de unión de tiorredoxina de la ADN polimerasa del bacteriófago T7 confiere procesividad a la ADN polimerasa I de Escherichia coli" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 94 (2): 479–84. Código Bibliográfico : 1997PNAS ... 94..479B . doi : 10.1073 / pnas.94.2.479 . PMC 19538 . PMID 9012809 .
- ^ Ghosh S, Hamdan SM, Cook TE, Richardson CC (noviembre de 2008). "Interacciones de la tiorredoxina de Escherichia coli, el factor de procesividad, con la ADN polimerasa del bacteriófago T7 y la helicasa" . La revista de química biológica . 283 (46): 32077–84. doi : 10.1074 / jbc.M805062200 . PMC 2581581 . PMID 18757858 .
- ^ a b c d Lee SJ, Richardson CC (octubre de 2011). "Coreografía de la replicación del ADN del bacteriófago T7" . Opinión actual en biología química . 15 (5): 580–6. doi : 10.1016 / j.cbpa.2011.07.024 . PMC 3195405 . PMID 21907611 .
- ^ Richardson, CC (1983). "Bacteriófago T7: requisitos mínimos para la replicación de una molécula de ADN dúplex" . Celular . 33 (2): 315–317. doi : 10.1016 / 0092-8674 (83) 90411-7 . PMID 6344999 .
- ^ Kelman Z, Hurwitz J, O'Donnell M (febrero de 1998). "Procesividad de las ADN polimerasas: dos mecanismos, un objetivo" . Estructura . 6 (2): 121–5. doi : 10.1016 / s0969-2126 (98) 00014-8 . PMID 9519403 .
- ^ Akabayov B, Akabayov SR, Lee SJ, Tabor S, Kulczyk AW, Richardson CC (agosto de 2010). "Dinámica conformacional de la ADN polimerasa del bacteriófago T7 y su factor de procesividad, tiorredoxina de Escherichia coli" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 107 (34): 15033–8. Código Bibliográfico : 2010PNAS..10715033A . doi : 10.1073 / pnas.1010141107 . PMC 2930546 . PMID 20696935 .
- ^ Hamdan SM, Johnson DE, Tanner NA, Lee JB, Qimron U, Tabor S, van Oijen AM, Richardson CC (agosto de 2007). "Las interacciones dinámicas de ADN helicasa-ADN polimerasa aseguran el movimiento de la horquilla de replicación procesiva" (PDF) . Célula molecular . 27 (4): 539–49. doi : 10.1016 / j.molcel.2007.06.020 . PMID 17707227 .
- ^ Tabor S, Richardson CC (noviembre de 1987). "Oxidación selectiva del dominio exonucleasa de la ADN polimerasa del bacteriófago T7". La revista de química biológica . 262 (32): 15330–3. PMID 2824455 .
- ^ Wuite GJ, Smith SB, Young M, Keller D, Bustamante C (marzo de 2000). "Estudios de una sola molécula del efecto de la tensión de la plantilla sobre la actividad de la ADN polimerasa de T7". Naturaleza . 404 (6773): 103–6. Código Bibliográfico : 2000Natur.404..103W . doi : 10.1038 / 35003614 . PMID 10716452 . S2CID 2270107 .
- ^ Bebenek K, Kunkel TA (julio de 1989). "El uso de la ADN polimerasa de T7 nativa para mutagénesis dirigida al sitio" . Investigación de ácidos nucleicos . 17 (13): 5408. doi : 10.1093 / nar / 17.13.5408 . PMC 318147 . PMID 2668888 .
- ^ Bodescot M, Brison O (septiembre de 1994). "Síntesis de ADNc de segunda hebra eficiente usando ADN polimerasa T7". ADN y biología celular . 13 (9): 977–85. doi : 10.1089 / dna.1994.13.977 . PMID 7522464 .
- ^ Fuller, CW; McArdle, BF; Griffin, AM; Griffin, HG (1996). Secuenciación de ADN usando la polimerasa de ADN T7 de la versión 2.0 de la secuencia . Métodos en Biología Molecular. 58 . págs. 373–87. doi : 10.1385 / 0-89603-402-X: 373 . ISBN 0-89603-402-X. PMID 8713887 .