Activación transcripcional controlada por tetraciclina

Método de expresión génica inducible

Ejemplo de un sistema T-REx que controla la expresión de shRNA

La activación transcripcional controlada por tetraciclina es un método de expresión génica inducible en el que la transcripción se activa o desactiva de forma reversible en presencia del antibiótico tetraciclina o uno de sus derivados (por ejemplo, doxiciclina ). ^[1]

La expresión génica controlada por tetraciclina se basa en el mecanismo de resistencia al tratamiento con antibióticos de tetraciclina que se encuentra en las bacterias gramnegativas . En la naturaleza, el promotor P _tet expresa TetR, el represor , y TetA, la proteína que bombea el antibiótico tetraciclina fuera de la célula. ^[2]

La diferencia entre Tet-On y Tet-Off no es si el transactivador activa o desactiva un gen, como sugiere el nombre; más bien, ambas proteínas activan la expresión. La diferencia se relaciona con su respuesta respectiva a la tetraciclina o doxiciclina (Dox, un análogo de tetraciclina más estable); Tet-Off activa la expresión en ausencia de Dox, mientras que Tet-On se activa en presencia de Dox.

Tet-Off y Tet-On

Los dos sistemas de expresión inducible más utilizados para la investigación de la biología celular eucariota se denominan Tet-Off y Tet-On. ^[3] El sistema Tet-Off para controlar la expresión de genes de interés en células de mamíferos fue desarrollado por los profesores Hermann Bujard  [ de ] y Manfred Gossen en la Universidad de Heidelberg y publicado por primera vez en 1992. ^[4]

El sistema Tet-Off utiliza la proteína transactivadora de tetraciclina (tTA) , que se crea fusionando una proteína , TetR (represor de tetraciclina), que se encuentra en la bacteria Escherichia coli , con el dominio de activación de otra proteína, VP16 , que se encuentra en el herpes. virus simplex . ^[5]

La proteína tTA resultante puede unirse al ADN en secuencias específicas del operador TetO . En la mayoría de los sistemas Tet-Off, varias repeticiones de tales secuencias TetO se colocan cadena arriba de un promotor mínimo como el promotor CMV . La totalidad de varias secuencias de TetO con un promotor mínimo se denomina elemento de respuesta a tetraciclina (TRE), porque responde a la unión de la proteína transactivadora de tetraciclina tTA mediante una mayor expresión del gen o genes cadena abajo de su promotor.

En un sistema Tet-Off, la expresión de genes controlados por TRE puede ser reprimida por tetraciclina y sus derivados. Se unen a tTA y lo vuelven incapaz de unirse a secuencias de TRE, evitando así la transactivación de genes controlados por TRE.

Un sistema Tet-On funciona de manera similar, pero de manera opuesta. Mientras que en un sistema Tet-Off, tTA es capaz de unir al operador solo si no está unido a la tetraciclina o uno de sus derivados, como la doxiciclina, en un sistema Tet-On, la proteína rtTA es capaz de unirse al operador solo si está unida por una tetraciclina. Por tanto, la introducción de doxiciclina en el sistema inicia la transcripción del producto genético. A veces se prefiere el sistema Tet-On sobre Tet-Off por su capacidad de respuesta más rápida.

Los sistemas de expresión Tet-Off también se utilizan para generar ratones transgénicos que expresan condicionalmente el gen de interés.

Tet-On Advanced y Tet-On 3G

El transactivador avanzado Tet-On (también conocido como rtTA2 ^S -M2) es una versión alternativa de Tet-On que muestra una expresión basal reducida y funciona a una concentración de Dox 10 veces menor que Tet-Off. Además, se considera que su expresión es más estable en células eucariotas debido a que tiene un codón humano optimizado y utiliza tres dominios de activación transcripcional mínimos. Fue descubierto en 2000 como uno de los dos mutantes mejorados por H. Bujard y sus colegas después de la mutagénesis aleatoria de la parte represora de Tet del gen transactivador. ^[6] Tet-On 3G (también conocido como rtTA-V10 ^[7] ) es similar a Tet-On Advanced pero se derivó de rtTA2 ^S -S2 en lugar de rtTA2 ^S-M2. También tiene un codón humano optimizado y está compuesto por tres dominios mínimos de activación de VP16. Sin embargo, la proteína Tet-On 3G tiene cinco diferencias de aminoácidos en comparación con Tet-On Advanced, que parecen aumentar aún más su sensibilidad a Dox. Tet-On 3G es sensible a 100 veces menos Dox y es siete veces más activo que el Tet-On original. ^[8]

Otros sistemas

Otros sistemas, como el sistema T-REx de Life Technologies, funcionan de forma diferente. ^[9] El gen de interés está flanqueado por un promotor de CMV corriente arriba y dos sitios TetO2. La expresión del gen de interés está reprimida por la unión de alta afinidad de los homodímeros de TetR a cada secuencia de TetO2 en ausencia de tetraciclina. La introducción de tetraciclina da como resultado la unión de una tetraciclina en cada homodímero de TetR seguida de la liberación de TetO2 por los homodímeros de TetR. La desvinculación de los homodímeros de TetR y TetO2 da como resultado la desrepresión del gen de interés.

Una versión modificada de T-REx es el circuito biológico sintético Linearizer , optimizado para el ajuste de la expresión génica en células eucariotas (levaduras en ciernes, humanas, etc.). Al incorporar sitios TetO2 en el promotor que impulsa la expresión de TetR, crea una retroalimentación negativa , lo que asegura una expresión homogénea (bajo ruido) y una dosis-respuesta lineal a los análogos de tetraciclina. ^[10]

Elemento de respuesta a tetraciclina (TRE)

En los plásmidos más comúnmente utilizados , el elemento de respuesta a la tetraciclina consta de siete repeticiones de la secuencia TetO bacteriana de 19 pb (TCCCTATCAGTGATAGAGA) separadas por secuencias espaciadoras (por ejemplo: ACGATGTCGAGTTTAC). Es el TetO el que es reconocido y vinculado por la porción TetR de Tet-On o Tet-Off. El TRE generalmente se coloca corriente arriba de un promotor mínimo que tiene una expresión basal muy baja en ausencia de Tet-Off (o Tet-On) unido.

Ventajas y desventajas

El sistema Tet tiene ventajas sobre los sistemas de expresión génica condicionales Cre , FRT y ER (receptor de estrógeno). En los sistemas Cre y FRT, la activación o desactivación del gen es irreversible una vez que se logra la recombinación, mientras que, en los sistemas Tet y ER, es reversible. El sistema Tet tiene un control muy estricto sobre la expresión, mientras que el sistema ER tiene algunas fugas. ^[11] Sin embargo, el sistema Tet, que depende de la transcripción y posterior traducción de un gen objetivo, no actúa tan rápido como el sistema ER, que estabiliza la proteína objetivo ya expresada tras la administración de hormonas. Además, dado que la secuencia tet-o de 19 pb está naturalmente ausente de las células de mamíferos, la pleiotropíase cree que se minimiza en comparación con los métodos hormonales de control. Cuando se usa el sistema Tet en cultivo celular, es importante confirmar que cada lote de suero fetal bovino se prueba para confirmar que las tetraciclinas contaminantes están ausentes o son demasiado bajas para interferir con la inducibilidad.

El mecanismo de acción del efecto antibacteriano de las tetraciclinas se basa en interrumpir la traducción de proteínas en las bacterias, lo que daña la capacidad de los microbios para crecer y repararse; sin embargo, la traducción de proteínas también se interrumpe en las mitocondrias eucariotas, lo que produce efectos que pueden confundir los resultados experimentales. ^[12]

Ver también

• Modelos de ratón de metástasis de cáncer de mama
• Atrapamiento de genes

Referencias

1. Gossen M, Freundlieb S, Bender G, Müller G, Hillen W, Bujard H (junio de 1995). "Activación de la transcripción vía tetraciclinas en células mamíferas". Ciencia . 268 (5218): 1766–9. Código Bibliográfico : 1995Sci ... 268.1766G . doi : 10.1126 / science.7792603 . PMID  7792603 .
2. Orth P, Schnappinger D, Hillen W, Saenger W, Hinrichs W (2000). "Base estructural de la regulación génica por el sistema represor-operador de Tet inducible por tetraciclina" (PDF) . Naturaleza Biología Molecular y Estructural . 7 (3): 215–219. doi : 10.1038 / 73324 . PMID 10700280 . S2CID 19973826 .   
3. Tet-On y Tet-Off son marcas comerciales registradas de Clontech Laboratories, Inc. en los Estados Unidos.
4. Gossen M, Bujard H (junio de 1992). "Control estricto de la expresión génica en células de mamífero por promotores sensibles a tetraciclina" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 89 (12): 5547–51. Código Bibliográfico : 1992PNAS ... 89.5547G . doi : 10.1073 / pnas.89.12.5547 . PMC 49329 . PMID 1319065 .  
5. Allen ND, Plagge A, Kelsey G (2000). "Mutagénesis dirigida en células madre embrionarias". En Jackson IJ, Abbott CM (eds.). Genética y transgénicos del ratón: un enfoque práctico . Prensa de la Universidad de Oxford. págs. 259-263. ISBN 978-0-19-963708-9.
6. Urlinger S, Baron U, Thellmann M, Hasan MT, Bujard H, Hillen W (julio de 2000). "Explorando el espacio de la secuencia para los activadores transcripcionales dependientes de tetraciclina: nuevas mutaciones producen un rango y una sensibilidad ampliados" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 97 (14): 7963–8. Código bibliográfico : 2000PNAS ... 97.7963U . doi : 10.1073 / pnas.130192197 . PMC 16653 . PMID 10859354 .  
7. Das AT, Tenenbaum L, Berkhout B (junio de 2016). "Sistemas Tet-On para la expresión génica inducible por doxiciclina" . Terapia génica actual . 16 (3): 156–67. doi : 10.2174 / 1566523216666160524144041 . PMC 5070417 . PMID 27216914 .  
8. Zhou X, Vink M, Klaver B, Berkhout B, Das AT (octubre de 2006). "Optimización del sistema Tet-On para la expresión génica regulada a través de la evolución viral" . Gene Ther . 13 (19): 1382–90. doi : 10.1038 / sj.gt.3302780 . PMID 16724096 . 
9. "Sistema T-REx" . ThermoFisher Scientific .
10. Nevozhay D, Adams RM, Murphy KF, Josic K, Balázsi G (31 de marzo de 2009). "La autorregulación negativa linealiza la dosis-respuesta y suprime la heterogeneidad de la expresión génica" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 106 (13): 5123–8. Código Bibliográfico : 2009PNAS..106.5123N . doi : 10.1073 / pnas.0809901106 . PMC 2654390 . PMID 19279212 .  
11. Sohal DS, Nghiem M, Crackower MA, Witt SA, Kimball TR, Tymitz KM, Penninger JM, Molkentin JD (julio de 2001). "Manipulaciones genéticas temporalmente reguladas y específicas de tejido en el corazón adulto y embrionario utilizando una proteína Cre inducible por tamoxifeno" . Circ. Res . 89 (1): 20–25. doi : 10.1161 / hh1301.092687 . PMID 11440973 . 
12. Moullan N, Mouchiroud L, Wang X, Ryu D, Williams EG, Mottis A, Jovaisaite V, Frochaux MV, Quiros PM, Deplancke B, Houtkooper RH, Auwerx J (marzo de 2015). "Las tetraciclinas perturban la función mitocondrial en modelos eucariotas: un llamado a la precaución en la investigación biomédica" . Rep . Celular 10 (10): 1681-1691. doi : 10.1016 / j.celrep.2015.02.034 . PMC 4565776 . PMID 25772356 .  
    - Chatzispyrou IA, Held NM, Mouchiroud L, Auwerx J, Houtkooper RH (noviembre de 2015). "Los antibióticos de tetraciclina deterioran la función mitocondrial y su uso experimental confunde la investigación" . Cancer Res . 75 (21): 4446–9. doi : 10.1158 / 0008-5472.CAN-15-1626 . PMC 4631686 . PMID 26475870 .  

enlaces externos

• Hermann Bujard Lab, ZMBH, Heidelberg, Alemania
• Animación avanzada de Tet-On en YouTube
• Una descripción detallada de los sistemas Tet en la investigación funcional del cáncer y la oncogenómica