Biología Molecular

Rama de la biología que estudia la actividad biológica a nivel molecular.

La "genética bioquímica" vuelve a dirigir aquí. Para la revista científica, consulte Biochemical Genetics (revista) .

La "microbiología molecular" vuelve a dirigir aquí. Para la revista científica, consulte Molecular Microbiology (revista) .

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Biología
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Biología molecular / m ə l ɛ k j ʊ l ər / es la rama de la biología que trata de comprender la molecular base de la actividad biológica en y entre las células , incluyendo molecular síntesis, modificación, mecanismos, y las interacciones. ^{[1] [2] [3]} La biología molecular se describió por primera vez como un enfoque centrado en los fundamentos de los fenómenos biológicos: descubrir las estructuras de las moléculas biológicas, así como sus interacciones, y cómo estas interacciones explican las observaciones de la biología clásica.^[4]

La biología molecular no es simplemente el estudio de moléculas biológicas y sus interacciones; más bien, también es una colección de técnicas desarrolladas desde la génesis del campo que han permitido a los científicos aprender sobre los procesos moleculares. ^[5] Una técnica notable que ha revolucionado el campo es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que se desarrolló en 1983. ^{[5] La} PCR es una reacción que amplifica pequeñas cantidades de ADN y se utiliza en muchas aplicaciones en todas las disciplinas científicas. como se discutirá más adelante. ^{[6] [7]}

El dogma central de la biología molecular describe el proceso por el cual el ADN se transcribe en ARN, que luego se traduce en proteína. ^{[2] [8]}

La biología molecular también desempeña un papel fundamental en la comprensión de las estructuras, funciones y controles internos dentro de las células individuales , todo lo cual se puede utilizar para atacar de manera eficiente nuevos medicamentos , diagnosticar enfermedades y comprender mejor la fisiología celular. ^[9] Algunas investigaciones clínicas y terapias médicas derivadas de la biología molecular están cubiertas por la terapia génica, mientras que el uso de la biología molecular o la biología celular molecular en medicina ahora se conoce como medicina molecular .

Historia

Artículo principal: Historia de la biología molecular.

Si bien la biología molecular se estableció como una rama oficial de la ciencia en la década de 1930, el término no fue acuñado hasta 1938 por Warren Weaver . En ese momento, Weaver fue el director de Ciencias Naturales de la Fundación Rockefeller y cree que la biología estaba a punto de experimentar un cambio significativo debido a los recientes avances en la tecnología, tales como la cristalografía de rayos X . ^{[10] [11]}

La biología molecular surgió como un intento de responder a las preguntas sobre los mecanismos de herencia genética y la estructura de un gen . En 1953, James Watson y Francis Crick publicaron la estructura de doble hélice del ADN ^[12] cortesía del trabajo de cristalografía de rayos X realizado por Rosalind Franklin y Maurice Wilkins . Watson y Crick describieron la estructura del ADN y las interacciones dentro de la molécula. Esta publicación impulsó la investigación en biología molecular y aumentó el interés en el tema. ^[13]

En 1961, se demostró que cuando un gen codifica una proteína , tres bases secuenciales del ADN de un gen especifican cada aminoácido sucesivo de la proteína. ^[14] Por lo tanto, el código genético es un código triplete, donde cada triplete (llamado codón) especifica un aminoácido en particular. Además, se demostró que los codones no se superponen entre sí en la secuencia de ADN que codifica una proteína y que cada secuencia se lee desde un punto de partida fijo. Durante 1962-1964, mediante el uso de mutantes letales condicionales de un virus bacteriano ^[15] , se lograron avances fundamentales en nuestra comprensión de las funciones e interacciones de las proteínas empleadas en la maquinaria deReplicación del ADN , reparación del ADN , recombinación del ADN y ensamblaje de estructuras moleculares.

Relación con otras ciencias biológicas

Relación esquemática entre bioquímica , genética y biología molecular

La siguiente lista describe un punto de vista sobre las relaciones interdisciplinarias entre la biología molecular y otros campos relacionados. ^[dieciséis]

• La biología molecular es el estudio de los fundamentos moleculares de los fenómenos biológicos, centrándose en la síntesis, modificación, mecanismos e interacciones moleculares.
• La bioquímica es el estudio de las sustancias químicas y los procesos vitales que ocurren en los organismos vivos. Los bioquímicos se centran en gran medida en el papel, la función y la estructura de biomoléculas como proteínas , lípidos , carbohidratos y ácidos nucleicos . ^[17]
• La genética es el estudio de cómo las diferencias genéticas afectan a los organismos. La genética intenta predecir cómo las mutaciones , los genes individualesy las interacciones genéticas pueden afectar la expresión de un fenotipo ^[18]

Si bien los investigadores practican técnicas específicas de la biología molecular, es común combinarlas con métodos de la genética y la bioquímica . Gran parte de la biología molecular es cuantitativa, y recientemente se ha realizado una cantidad significativa de trabajo utilizando técnicas informáticas como la bioinformática y la biología computacional . La genética molecular , el estudio de la estructura y función de los genes, ha sido uno de los subcampos más destacados de la biología molecular desde principios de la década de 2000. Otras ramas de la biología se basan en la biología molecular, ya sea estudiando directamente las interacciones de las moléculas por derecho propio, como en la biología celular y la biología del desarrollo., o indirectamente, donde se utilizan técnicas moleculares para inferir atributos históricos de poblaciones o especies , como en campos de la biología evolutiva como la genética de poblaciones y la filogenética . También existe una larga tradición de estudiar biomoléculas "desde cero", o molecularmente, en biofísica . ^[19]

Técnicas de biología molecular

Animación de ADN

Para obtener una lista más extensa sobre métodos de proteínas, consulte métodos de proteínas . Para obtener una lista más extensa de métodos de ácidos nucleicos, consulte métodos de ácidos nucleicos .

Clonación molecular

Artículo principal: Clonación molecular

Imagen de transducción

La clonación molecular es una tecnología de ADN recombinante que se desarrolló por primera vez en la década de 1960. ^[20] En esta técnica, el ADN que codifica una proteína de interés se clona mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y / o enzimas de restricción en un plásmido ( vector de expresión ). Un vector tiene 3 características distintivas: un origen de replicación, un sitio de clonación múltiple (MCS) y un marcador selectivo (generalmente resistencia a los antibióticos) . Aguas arriba del sitio de clonación múltiple están las regiones promotoras y el sitio de inicio de la transcripción , que regulan la expresión del gen clonado.

Este plásmido se puede insertar en células bacterianas o animales. La introducción de ADN en células bacterianas se puede realizar mediante transformación mediante la captación de ADN desnudo, conjugación mediante contacto célula-célula o mediante transducción mediante un vector viral. La introducción de ADN en células eucariotas , como las células animales, por medios físicos o químicos se denomina transfección . Se encuentran disponibles varias técnicas de transfección diferentes, tales como transfección con fosfato de calcio, electroporación , microinyección y transfección de liposomas . El plásmido puede integrarse en el genoma., lo que da como resultado una transfección estable, o puede permanecer independiente del genoma, lo que se denomina transfección transitoria. ^{[21] [22]}

El ADN que codifica una proteína de interés ahora se encuentra dentro de una célula y la proteína ahora se puede expresar. Una variedad de sistemas, como promotores inducibles y factores de señalización celular específicos, están disponibles para ayudar a expresar la proteína de interés en niveles altos. A continuación, se pueden extraer grandes cantidades de una proteína de la célula bacteriana o eucariota. La proteína se puede probar para determinar su actividad enzimática en una variedad de situaciones, la proteína se puede cristalizar para estudiar su estructura terciaria o, en la industria farmacéutica, se puede estudiar la actividad de nuevos fármacos contra la proteína. ^[23]

Reacción en cadena de la polimerasa

Artículo principal: reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica extremadamente versátil para copiar ADN. En resumen, la PCR permite copiar o modificar una secuencia de ADN específica de formas predeterminadas. La reacción es extremadamente poderosa y en condiciones perfectas podría amplificar una molécula de ADN para convertirse en 1.07 mil millones de moléculas en menos de dos horas. La PCR tiene muchas aplicaciones, incluido el estudio de la expresión génica, la detección de microorganismos patógenos, la detección de mutaciones genéticas y la introducción de mutaciones en el ADN. ^[24] La técnica de PCR se puede utilizar para introducir sitios de enzimas de restricción en los extremos de las moléculas de ADN, o para mutar bases particulares de ADN, este último es un método denominado mutagénesis dirigida al sitio.. La PCR también se puede usar para determinar si un fragmento de ADN particular se encuentra en una biblioteca de ADNc . La PCR tiene muchas variaciones, como la PCR de transcripción inversa ( RT-PCR ) para la amplificación de ARN y, más recientemente, la PCR cuantitativa que permite la medición cuantitativa de moléculas de ADN o ARN. ^{[25] [26]}

Electroforesis en gel

SDS-PAGE

Artículo principal: electroforesis en gel

Gel de agarosa al dos por ciento en tampón de borato vertido en una bandeja de gel.

La electroforesis en gel es una de las principales herramientas de la biología molecular. El principio básico es que el ADN, el ARN y las proteínas pueden separarse mediante un campo eléctrico y su tamaño. En la electroforesis en gel de agarosa , el ADN y el ARN se pueden separar en función del tamaño pasando el ADN a través de un gel de agarosa cargado eléctricamente. Las proteínas se pueden separar en función del tamaño mediante el uso de un gel SDS-PAGE , o en función del tamaño y su carga eléctrica mediante el uso de lo que se conoce como electroforesis en gel 2D . ^[27]

El ensayo de Bradford

Artículo principal: El ensayo de Bradford

El ensayo de Bradford es una técnica de biología molecular que permite la cuantificación rápida y precisa de moléculas de proteínas utilizando las propiedades únicas de un tinte llamado Coomassie Brilliant Blue G-250. ^[28] Coomassie Blue experimenta un cambio de color visible de marrón rojizo a azul brillante al unirse a la proteína. ^[28] En su estado catiónico inestable, el azul de Coomassie tiene una longitud de onda de fondo de 465 nm y emite un color marrón rojizo. ^[29] Cuando Coomassie Blue se une a la proteína en una solución ácida, la longitud de onda de fondo cambia a 595 nm y el tinte emite un color azul brillante. ^[29]Las proteínas en el ensayo se unen al azul de Coomassie en aproximadamente 2 minutos, y el complejo proteína-colorante es estable durante aproximadamente una hora, aunque se recomienda que las lecturas de absorbancia se tomen dentro de los 5 a 20 minutos posteriores al inicio de la reacción. ^[28] La concentración de proteína en el ensayo de Bradford se puede medir usando un espectrofotómetro de luz visible y, por lo tanto, no requiere un equipo extenso. ^[29]

Este método fue desarrollado en 1975 por Marion M. Bradford y ha permitido una cuantificación de proteínas significativamente más rápida y precisa en comparación con los métodos anteriores: el procedimiento de Lowry y el ensayo de biuret. ^[28] A diferencia de los métodos anteriores, el ensayo de Bradford no es susceptible a la interferencia de varias moléculas no proteicas, incluidos el etanol, el cloruro de sodio y el cloruro de magnesio. ^[28]  Sin embargo, es susceptible a la influencia de agentes tamponadores alcalinos fuertes, como el dodecilsulfato de sodio (SDS). ^[28]

Transferencia y sondaje de macromoléculas

Los términos transferencia del norte , oeste y este se derivan de lo que inicialmente era una broma de biología molecular que jugaba con el término transferencia de Southern , después de la técnica descrita por Edwin Southern para la hibridación de ADN borrado. Patricia Thomas, desarrolladora de la transferencia de ARN que luego se conoció como transferencia del norte , en realidad no usó el término. ^[30]

Transferencia del sur

Artículo principal: Southern blot

El nombre de su inventor, el biólogo Edwin Southern , el Southern blot es un método para sondear la presencia de una secuencia de ADN específica dentro de una muestra de ADN. Las muestras de ADN antes o después de la digestión con enzimas de restricción (endonucleasa de restricción) se separan mediante electroforesis en gel y luego se transfieren a una membrana mediante transferencia por capilaridad . Luego, la membrana se expone a una sonda de ADN marcada que tiene una secuencia de bases complementaria a la secuencia del ADN de interés. ^[31] La transferencia Southern se utiliza con menos frecuencia en las ciencias de laboratorio debido a la capacidad de otras técnicas, como la PCR., para detectar secuencias de ADN específicas a partir de muestras de ADN. Estas transferencias se utilizan todavía para algunas aplicaciones, sin embargo, como la medición transgén número de copias en ratones transgénicos o en la ingeniería de gen knockout líneas de células madre embrionarias . ^[19]

Transferencia del norte

Artículo principal: Northern blot

Diagrama de transferencia Northern

La transferencia Northern se utiliza para estudiar la presencia de moléculas de ARN específicas como comparación relativa entre un conjunto de diferentes muestras de ARN. Es esencialmente una combinación de electroforesis en gel de ARN desnaturalizante y una mancha . En este proceso, el ARN se separa según el tamaño y luego se transfiere a una membrana que luego se prueba con un complemento marcado.de una secuencia de interés. Los resultados pueden visualizarse a través de una variedad de formas dependiendo de la etiqueta utilizada; sin embargo, la mayoría resulta en la revelación de bandas que representan los tamaños del ARN detectado en la muestra. La intensidad de estas bandas está relacionada con la cantidad de ARN diana en las muestras analizadas. El procedimiento se usa comúnmente para estudiar cuándo y cuánta expresión génica está ocurriendo midiendo cuánto de ese ARN está presente en diferentes muestras, asumiendo que no se produce una regulación postranscripcional y que los niveles de ARNm reflejan niveles proporcionales de la proteína correspondiente que está siendo producido. Es una de las herramientas más básicas para determinar en qué momento y en qué condiciones se expresan ciertos genes en los tejidos vivos. ^{[32] [33]}

Western blot

Artículo principal: Western blot

En la transferencia Western , las proteínas se separan primero por tamaño, en un gel delgado intercalado entre dos placas de vidrio en una técnica conocida como SDS-PAGE . Las proteínas del gel se transfieren luego a un fluoruro de polivinilideno (PVDF), nitrocelulosa, nailon u otra membrana de soporte. A continuación, esta membrana se puede sondar con soluciones de anticuerpos . Los anticuerpos que se unen específicamente a la proteína de interés pueden visualizarse luego mediante una variedad de técnicas, que incluyen productos coloreados, quimioluminiscencia o autorradiografía . A menudo, los anticuerpos se marcan con enzimas. Cuando un sustrato quimioluminiscente se expone a la enzimapermite la detección. El uso de técnicas de Western Blot permite no solo la detección sino también el análisis cuantitativo. Pueden usarse métodos análogos a la transferencia Western para teñir directamente proteínas específicas en células vivas o secciones de tejido . ^{[34] [35]}

Blot del este

Artículo principal: mancha oriental

La técnica de transferencia oriental se utiliza para detectar modificaciones postraduccionales de proteínas. Las proteínas que se transfieren al PVDF o la membrana de nitrocelulosa se prueban en busca de modificaciones utilizando sustratos específicos. ^[36]

Microarrays

Artículo principal: microarrays de ADN

Reproducir medios

Se está imprimiendo una micromatriz de ADN

Hibridación de objetivo a sonda

Una micromatriz de ADN es una colección de puntos adheridos a un soporte sólido, como un portaobjetos de microscopio, donde cada punto contiene uno o más fragmentos de oligonucleótidos de ADN monocatenarios . Las matrices permiten colocar grandes cantidades de puntos muy pequeños (100 micrómetros de diámetro) en una sola diapositiva. Cada punto tiene una molécula de fragmento de ADN que es complementaria a una única secuencia de ADN . Una variación de esta técnica permite calificar la expresión génica de un organismo en una etapa particular de desarrollo ( perfil de expresión ). En esta técnica, el ARN de un tejido se aísla y se convierte en ADN complementario marcado.(ADNc). A continuación, este ADNc se hibrida con los fragmentos de la matriz y se puede realizar la visualización de la hibridación. Dado que se pueden hacer múltiples matrices con exactamente la misma posición de fragmentos, son particularmente útiles para comparar la expresión génica de dos tejidos diferentes, como un tejido sano y canceroso. Además, se puede medir qué genes se expresan y cómo esa expresión cambia con el tiempo o con otros factores. Hay muchas formas diferentes de fabricar microarrays; los más comunes son los chips de silicio, los portaobjetos de microscopio con manchas de ~ 100 micrómetros de diámetro, matrices personalizadas y matrices con manchas más grandes en membranas porosas (macroarrays). Puede haber desde 100 puntos hasta más de 10,000 en una matriz determinada. Las matrices también se pueden hacer con moléculas distintas del ADN. ^{[37] [38][39] [40]}

Oligonucleótido específico de alelo

Artículo principal: oligonucleótido específico de alelo

El oligonucleótido específico de alelo (ASO) es una técnica que permite la detección de mutaciones de una sola base sin necesidad de PCR o electroforesis en gel. Las sondas marcadas, cortas (20-25 nucleótidos de longitud) se exponen al ADN diana no fragmentado, la hibridación se produce con alta especificidad debido a la longitud corta de las sondas e incluso un cambio de una sola base dificultará la hibridación. A continuación, se lava el ADN diana y se eliminan las sondas marcadas que no se hibridaron. A continuación, se analiza el ADN diana para determinar la presencia de la sonda mediante radiactividad o fluorescencia. En este experimento, como en la mayoría de las técnicas de biología molecular, se debe utilizar un control para asegurar una experimentación exitosa. ^{[41] [42]}

En biología molecular, los procedimientos y tecnologías se desarrollan continuamente y las tecnologías más antiguas se abandonan. Por ejemplo, antes del advenimiento de la electroforesis en gel de ADN ( agarosa o poliacrilamida ), el tamaño de las moléculas de ADN se determinaba típicamente por velocidad de sedimentación en gradientes de sacarosa , una técnica lenta y laboriosa que requiere instrumentación costosa; antes de los gradientes de sacarosa, se utilizó viscosimetría . Aparte de su interés histórico, a menudo vale la pena conocer la tecnología más antigua, ya que en ocasiones es útil para resolver otro problema nuevo para el que la técnica más nueva es inapropiada. ^[43]

Ver también

• Astrobiología
• Dogma central de la biología molecular
• Codigo genetico
• Analizador Geniom RT , instrumento de prueba de diagnóstico
• Genoma
• Institutos de biología molecular
• Ingeniería molecular
• Microbiología molecular
• Modelado molecular
• Predicción de la interacción de proteínas
• Predicción de la estructura de proteínas
• Proteoma
• Biología Celular

Referencias

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Otras lecturas

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• Roberts K, Raff M, Alberts B, Walter P, Lewis J, Johnson A (2002). Biología molecular de la célula . Garland Science. ISBN 978-0-8153-3218-3.

enlaces externos

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