Los multímeros MHC son formas oligoméricas de moléculas MHC , diseñadas para identificar y aislar células T con alta afinidad por antígenos específicos en medio de un gran grupo de células T no relacionadas. [1] Los multímeros generalmente varían en tamaño desde dímeros hasta octámeros; sin embargo, algunas empresas utilizan cantidades aún mayores de MHC por multímero. Se pueden usar multímeros para mostrar MHC de clase 1 , MHC de clase 2 o moléculas no clásicas (por ejemplo, CD1d ) de especies tales como monos, ratones y humanos.
Fondo
Dado que los receptores de células T tienen una baja afinidad por sus contrapartes MHC, históricamente fue problemático etiquetar las células T de manera eficaz utilizando interacciones únicas de células T-MHC. [2] Sin embargo, en 1996 John Altman propuso utilizar un complejo de múltiples moléculas MHC para formar un enlace más estable entre las células T correspondientes. [3]
Producción
Los multímeros de MHC más utilizados son los tetrámeros. [3] Estos se producen típicamente mediante la biotinilación de monómeros MHC solubles, que normalmente se producen de forma recombinante en células eucariotas o bacterianas. Estos monómeros luego se unen a una columna vertebral, como estreptavidina o avidina , creando una estructura tetravalente. Estas cadenas principales se conjugan con fluorocromos para aislar posteriormente las células T unidas mediante citometría de flujo . [4]
Posibles aplicaciones clínicas
Los multímeros de MHC permiten un nivel de especificidad previamente inalcanzable en la detección y el aislamiento de células T específicas de antígeno. Esta capacidad da lugar a varias aplicaciones clínicas. Los multímeros de MHC permiten la selección ex vivo y la proliferación de células T específicas para antígenos virales o relacionados con tumores, que luego pueden reintroducirse para aumentar el sistema inmunológico. Los multímeros de MHC también se pueden usar para eliminar las células T que se originan en el injerto en órganos de trasplante, ex vivo. Los multímeros de MHC también se pueden usar para eliminar células T dañinas o no deseadas in vivo, como las que se dirigen a las propias células y conducen a enfermedades autoinmunes. [4] [5] [6] Esta tecnología también puede influir en gran medida en la inmunoterapia contra el cáncer y el desarrollo de vacunas. [7]
Subtipos
Tetrámero de MHC
Los tetrámeros de MHC constan de cuatro moléculas de MHC, un agente de tetramerización y una proteína marcada con fluorescencia (generalmente estreptavidina). También se han generado estreptavidinas con 6 o 12 sitios de unión para MHC. [8] Los tetrámeros de MHC se utilizan para identificar y marcar células T específicas mediante unión específica de epítopo, lo que permite analizar la respuesta inmune específica de antígeno tanto en modelo animal como en humano. [9] Los tetrámeros de MHC se desarrollaron originalmente utilizando moléculas de MHC de clase I para el reconocimiento de células T citotóxicas , [10] [11] pero durante la última década han permitido el reconocimiento de células T CD4 por una amplia variedad de antígenos. Los ensayos de tetramero se utilizan para el fenotipado y el recuento de células unicelulares, y ofrecen una ventaja importante sobre otros métodos, como ELISPOT y la PCR unicelular, ya que permiten la recuperación y el estudio adicional de las células clasificadas. Como aplicación basada en citometría de flujo, los tetrámeros también son fáciles de usar y tienen un tiempo de ensayo corto, similar a los estudios de citometría de flujo basados en anticuerpos. [4]
Los tetrámeros de MHC se utilizan en estudios de inmunidad a patógenos y desarrollo de vacunas, en evaluación de respuestas antitumorales, en estudios de monitorización y desensibilización de alergias y en autoinmunidad. [4] [12] Proporcionan un medio ideal para caracterizar las células T que responden a una vacuna, y se han utilizado para evaluar las respuestas de las células T en muchos sistemas de vacunas, incluida la influenza , [13] la fiebre amarilla , [14] la tuberculosis , [15] VIH / VIS [16] y un gran número de ensayos de vacunas contra el cáncer, [17] incluidos el melanoma y la leucemia mieloide crónica . [18] Los tetrámeros de clase II se han utilizado para el análisis de una variedad de respuestas de células T CD4 humanas a patógenos, incluidos influenza A , Borrelia , virus de Epstein-Barr , CMV , Mycobacterium tuberculosis , virus linfotrópico T humano 1 , hepatitis C , ántrax , virus del síndrome respiratorio agudo severo, virus del papiloma humano y VIH. [4] Se han desarrollado variantes de tetrameros que, ya sea radiomarcadas o acopladas a una toxina como la saporina , pueden inyectarse en ratones vivos para modular o incluso agotar poblaciones específicas de células T. [19] [20] Los tetrámeros péptido-MHC también se han utilizado con fines terapéuticos. [21] Por ejemplo, las células T específicas del citomegalovirus se han enriquecido a altos niveles de pureza utilizando un enriquecimiento basado en perlas magnéticas para su uso como terapia en pacientes con trasplante de células madre . [12]
Pentámero MHC
Los pentámeros constan de cinco grupos de cabezas de péptidos MHC, dispuestos en una configuración plana de modo que, a diferencia de los tetrámeros de MHC, todos los grupos de cabezas pueden contactar con la célula T CD8 +. Los grupos de cabeza están conectados a través de conectores flexibles a un dominio de multimerización de bobina enrollada , que a su vez está conectado a cinco etiquetas de biotina o fluorescentes. Los pentámeros están disponibles con etiquetado APC, R-PE o biotina, y también sin etiquetar con etiquetas separadas para almacenamiento a largo plazo. Los pentámeros ofrecen mayor brillo y avidez de tinción en comparación con otros reactivos multímeros.
Los pentámeros MHC se han utilizado en la detección de células T CD8 + específicas de antígeno en citometría de flujo, [12] y se citan en más de 750 publicaciones revisadas por pares [1] , incluidas varias en las revistas Nature [22] y Science . [23] [24] Los pentámeros de MHC también se pueden usar en la tinción de tejidos, [25] y en el aislamiento magnético de células T específicas de antígeno. [26]
Si bien los pentámeros tienen licencia para uso exclusivo en investigación, en 2009 se otorgó una dispensa especial para que un equipo los usara para aislar células T específicas del VEB para la transferencia madre-hija, para el tratamiento que salvó la vida del linfoma asociado al VEB en la hija. [27]
Hay pentameros disponibles para antígenos de las siguientes áreas de enfermedad: adenovirus , VHC , malaria , VIS , enfermedad autoinmune , VIH , antígenos de trasplante, tripanosoma , cáncer , VPH , tuberculosis , clamidia , HTLV , vaccinia , CMV , influenza , VSV , EBV , LCMV , RSV , virus del Nilo Occidental , VHB , Listeria , virus Sendai , fiebre amarilla . También se pueden encargar pentámeros de especificidad personalizados.
Los pentámeros se utilizan actualmente en la investigación por parte de la academia, la industria y los médicos, y la investigación con pentámeros ha aparecido en los medios internacionales [2] [3] en varias ocasiones.
Dextrámero MHC
Una forma de multímero de MHC desarrollado y registrado por la compañía de biotecnología danesa Immudex en 2002. Los reactivos dextrámeros están marcados con fluorescencia con FITC, PE o APC y contienen moléculas de MHC unidas a una columna vertebral de dextrano , que se utilizan para detectar T- específicos de antígeno. células en células fluidas y muestras de tejido sólido mediante citometría de flujo. Estas células T contienen receptores de células T (TCR) que reconocen un complejo MHC-péptido específico que se muestra en la superficie de las células presentadoras de antígenos, lo que permite la detección, el aislamiento y la cuantificación de estas poblaciones específicas de células T debido a una señal mejorada. -relación de ruido no presente en generaciones anteriores de multímeros. [3] [12] [28]
Se han desarrollado dextrámeros con una mayor cantidad de péptidos MHC para varios genes humanos, de ratón y macacos rhesus involucrados en enfermedades que incluyen, entre otras , cáncer , VIH , virus de Epstein-Barr (EBV), citomegalovirus (CMV), LCMV, virus del papiloma humano (VPH), poliomavirus BK , HTLV, hepatitis , micobacterias y enfermedad de injerto contra huésped .
La tecnología dextramer se utiliza actualmente en investigación académica y clínica debido a su mayor especificidad y afinidad de unión, lo que permite una mayor avidez por células T específicas y mejora la intensidad de la tinción. Esta ventaja es el resultado de la mayor capacidad de los dextrámeros para unirse varias veces a una sola célula T, mejorando la estabilidad de esta interacción en comparación con otras tecnologías multiméricas como los pentámeros y tetrámeros. Otras aplicaciones incluyen la capacidad de aislar poblaciones de células T específicas de antígeno, así como la detección in situ mediante inmunohistoquímica (IHC) para diversos estados patológicos (por ejemplo, tumores sólidos). Por tanto, estos reactivos son importantes para el desarrollo futuro de fármacos y vacunas. [1] [12] [28] [29] [30]
Immudex ha desarrollado actualmente un ensayo de dextramero de CMV para la detección exploratoria y la cuantificación de células T CD8 + en muestras de sangre, que cubre una amplia gama de epítopos para ayudar con la detección y el seguimiento de la progresión del CMV en entornos clínicos futuros. [31] Actualmente, los dextrámeros solo están disponibles con moléculas de MHC de clase I, y existe un futuro desarrollo e investigación sobre las aplicaciones y la producción de los dextrámeros de MHC de clase II. [32]
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