Cas9 ( C RISPR como proteína asociada 9 , anteriormente llamada Cas5, Csn1 o Csx12) es una proteína de 160 kilodalton que desempeña un papel vital en la defensa inmunológica de ciertas bacterias contra virus y plásmidos de ADN , y se utiliza mucho en aplicaciones de ingeniería genética . Su función principal es cortar el ADN y así alterar el genoma de una célula. La técnica de edición del genoma CRISPR-Cas9 fue un importante contribuyente al Premio Nobel de Química en 2020 otorgado a Emmanuelle Charpentier y Jennifer Doudna .[2]
Endonucleasa Cas9 asociada a CRISPR | ||||||
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Identificadores | ||||||
Organismo | ||||||
Símbolo | cas9 | |||||
Alt. simbolos | SpCas9 | |||||
Entrez | 901176 | |||||
PDB | 4OO8 | |||||
RefSeq (ARNm) | NC_002737.2 | |||||
RefSeq (Prot) | NP_269215.1 | |||||
UniProt | Q99ZW2 | |||||
Otros datos | ||||||
Número CE | 3.1.-.- | |||||
Cromosoma | Genómico: 0,85 - 0,86 Mb | |||||
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Más técnicamente, Cas9 es un dual ARN guiada por ADN endonucleasa de enzima Regularmente Interspaced Short palindrómica Repeats (asociado con el clúster CRISPR sistema inmune adaptativo) en Streptococcus pyogenes . [3] [4] S. pyogenes utiliza CRISPR para memorizar y Cas9 para interrogar y escindir posteriormente ADN extraño, como ADN de bacteriófago invasor o ADN de plásmido. [4] [5] [6] [7] Cas9 realiza este interrogatorio desenrollando ADN extraño y buscando sitios complementarios a la región espaciadora de 20 pares de bases del ARN guía . Si el sustrato de ADN es complementario al ARN guía, Cas9 escinde el ADN invasor. En este sentido, el mecanismo CRISPR-Cas9 tiene una serie de paralelismos con el mecanismo de interferencia de ARN (ARNi) en eucariotas.
Aparte de su función original en la inmunidad bacteriana, la proteína Cas9 se ha utilizado mucho como una herramienta de ingeniería del genoma para inducir roturas de doble cadena en el ADN dirigidas al sitio. Estas rupturas pueden conducir a la inactivación de genes o la introducción de genes heterólogos a través de la unión de extremos no homólogos y la recombinación homóloga, respectivamente, en muchos organismos modelo de laboratorio. Junto con las nucleasas de dedos de zinc y las proteínas nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), Cas9 se está convirtiendo en una herramienta destacada en el campo de la edición del genoma.
Cas9 ha ganado terreno en los últimos años porque puede escindir casi cualquier secuencia complementaria al ARN guía. [4] Debido a que la especificidad del objetivo de Cas9 proviene del ARN guía: complementariedad del ADN y no modificaciones de la proteína en sí (como TALEN y dedos de zinc ), diseñar Cas9 para apuntar al nuevo ADN es sencillo. [8] Las versiones de Cas9 que se unen pero no escinden el ADN afín pueden usarse para localizar activadores o represores transcripcionales en secuencias específicas de ADN con el fin de controlar la activación y represión transcripcional. [9] [10] Native Cas9 requiere un ARN guía compuesto de dos ARNs dispares que asociado - el ARN CRISPR (crRNA), y la crRNA activadora trans ( tracrRNA ). [3] El direccionamiento de Cas9 se ha simplificado mediante la ingeniería de un ARN de guía único quimérico (chiRNA). Los científicos han sugerido que los impulsores genéticos basados en Cas9 pueden ser capaces de editar los genomas de poblaciones enteras de organismos. [11] En 2015, Cas9 se utilizó para modificar el genoma de embriones humanos por primera vez. [12]
Inmunidad mediada por CRISPR
Para sobrevivir en una variedad de hábitats desafiantes e inhóspitos que están llenos de bacteriófagos , bacterias y arqueas, se han desarrollado métodos para evadir y defenderse de los virus depredadores . Esto incluye el sistema CRISPR de inmunidad adaptativa. En la práctica, los sistemas CRISPR / Cas actúan como enzimas de restricción autoprogramables. Los loci CRISPR están compuestos por repeticiones palindrómicas cortas que ocurren a intervalos regulares compuestos por repeticiones CRISPR alternas y espaciadores CRISPR variables entre 24-48 nucleótidos de longitud. Estos loci CRISPR suelen ir acompañados de genes adyacentes asociados a CRISPR (cas). En 2005, tres grupos separados descubrieron que las regiones espaciadoras eran homólogas a los elementos extraños del ADN, incluidos los plásmidos y los virus. Estos informes proporcionaron la primera evidencia biológica de que los CRISPR podrían funcionar como un sistema inmunológico.
Cas9 se ha utilizado a menudo como herramienta de edición del genoma. Cas9 se ha utilizado en desarrollos recientes para evitar que los virus manipulen el ADN de los huéspedes. Dado que CRISPR-Cas9 se desarrolló a partir de sistemas de genoma bacteriano, se puede utilizar para apuntar al material genético en virus. El uso de la enzima Cas9 puede ser una solución para muchas infecciones virales. Cas9 posee la capacidad de apuntar a virus específicos dirigiéndose a hebras específicas de la información genética viral. Más específicamente, la enzima Cas9 se dirige a ciertas secciones del genoma viral que impide que el virus lleve a cabo su función normal. [13] Cas9 también se ha utilizado para alterar la hebra perjudicial de ADN y ARN que causa enfermedades y hebras mutadas de ADN. Cas9 ya se ha mostrado prometedor en la interrupción de los efectos del VIH-1. Se ha demostrado que Cas9 suprime la expresión de las repeticiones terminales largas en el VIH-1. Cuando se introdujo en el genoma del VIH-1, Cas9 ha demostrado la capacidad de mutar hebras del VIH-1. [14] [15] Cas9 también se ha utilizado en el tratamiento de la hepatitis b mediante el direccionamiento de los extremos de ciertas repeticiones terminales largas en el genoma viral de la hepatitis b. [16] Cas9 se ha utilizado para reparar las mutaciones que causan cataratas en ratones.
Los sistemas CRISPR-Cas se dividen en tres tipos principales (tipo I, tipo II y tipo III) y doce subtipos, que se basan en su contenido genético y diferencias estructurales. Sin embargo, las características fundamentales que definen a todos los sistemas CRISPR-Cas son los genes cas y sus proteínas: cas1 y cas2 son universales en todos los tipos y subtipos, mientras que cas3 , cas9 y cas10 son genes característicos de los tipos I, II y III , respectivamente.
Etapas de defensa CRISPR-Cas
Adaptación
La adaptación implica el reconocimiento y la integración de espaciadores entre dos repeticiones adyacentes en el locus CRISPR. El "protoespaciador" se refiere a la secuencia del genoma viral que corresponde al espaciador. Existe un tramo corto de nucleótidos conservados proximal al protoespaciador, que se denomina motivo adyacente del protoespaciador (PAM). El PAM es un motivo de reconocimiento que se utiliza para adquirir el fragmento de ADN. [7] En el tipo II, Cas9 reconoce el PAM durante la adaptación para asegurar la adquisición de espaciadores funcionales. [5]
Procesamiento CRISPR / biogénesis
La expresión de CRISPR incluye la transcripción de una transcripción primaria llamada ARN CRISPR (pre-crRNA), que se transcribe desde el locus CRISPR por la ARN polimerasa. Las endoribonucleasas específicas luego escinden los pre-crRNA en pequeños CRISPR RNA (crRNA). [17]
Interferencia / inmunidad
La interferencia involucra a los crRNA dentro de un complejo de múltiples proteínas llamado CASCADE, que puede reconocer y específicamente formar pares de bases con regiones de inserción de ADN extraño complementario. A continuación, se escinde el complejo de crRNA-ácido nucleico extraño; sin embargo, si hay desajustes entre el espaciador y el ADN diana, o si hay mutaciones en el PAM, no se iniciará la escisión. En el último escenario, el ADN extraño no está dirigido al ataque de la célula, por lo que la replicación del virus continúa y el huésped no es inmune a la infección viral. La etapa de interferencia puede ser mecánica y temporalmente distinta de la adquisición y expresión de CRISPR, pero para una función completa como sistema de defensa, las tres fases deben ser funcionales. [18]
Etapa 1: Integración del espaciador CRISPR. Los protospaciadores y los motivos asociados a protoespaciadores (mostrados en rojo) se adquieren en el extremo "líder" de una matriz CRISPR en el ADN del huésped. La matriz CRISPR se compone de secuencias espaciadoras (mostradas en cuadros de colores) flanqueadas por repeticiones (diamantes negros). Este proceso requiere Cas1 y Cas2 (y Cas9 en el tipo II [5] ), que están codificados en el locus cas, que generalmente se encuentran cerca de la matriz CRISPR.
Etapa 2: expresión CRISPR. El pre-crRNA se transcribe comenzando en la región líder por la RNA polimerasa del anfitrión y luego es escindido por las proteínas Cas en crRNA más pequeños que contienen un solo espaciador y una repetición parcial (mostrada como una estructura de horquilla con espaciadores de colores).
Etapa 3: interferencia CRISPR. El ARNcr con un espaciador que tiene una fuerte complementariedad con el ADN extraño entrante comienza un evento de escisión (representado con tijeras), que requiere proteínas Cas. La escisión del ADN interfiere con la replicación viral y proporciona inmunidad al huésped. La etapa de interferencia puede ser funcional y temporalmente distinta de la adquisición y expresión de CRISPR (representada por una línea blanca que divide la célula).
Desactivación de la transcripción mediante dCas9
dCas9, también denominado Cas9 deficiente en endonucleasas, se puede utilizar para editar la expresión génica cuando se aplica al sitio de unión a la transcripción de la sección deseada de un gen. La función óptima de dCas9 se atribuye a su modo de acción. La expresión génica se inhibe cuando ya no se agregan nucleótidos a la cadena de ARN y, por lo tanto, se termina el alargamiento de esa cadena y, como resultado, afecta el proceso de transcripción. Este proceso ocurre cuando dCas9 se produce en masa, por lo que puede afectar a la mayor cantidad de genes en un momento dado a través de una molécula de ARN guía específica de secuencia. Dado que dCas9 parece regular negativamente la expresión génica, esta acción se amplifica aún más cuando se usa junto con dominios modificadores de cromatina represivos. [19] La proteína dCas9 tiene otras funciones fuera de la regulación de la expresión génica. Se puede agregar un promotor a la proteína dCas9 que les permite trabajar entre sí para volverse eficientes al comenzar o detener la transcripción en diferentes secuencias a lo largo de una hebra de ADN. Estas dos proteínas son específicas donde actúan sobre un gen. Esto es frecuente en ciertos tipos de procariotas cuando un promotor y dCas9 se alinean para impedir la capacidad de elongación del polímero de nucleótidos que se unen para formar un fragmento de ADN transcrito. Sin el promotor, la proteína dCas9 no tiene el mismo efecto por sí misma o con un cuerpo genético. [20]
Al examinar más los efectos de la represión de la transcripción, H3K27, un componente de aminoácido de una histona, se metila a través de la interacción de dCas9 y un péptido llamado FOG1. Esencialmente, esta interacción causa la represión génica en la sección terminal C + N del complejo de aminoácidos en la unión específica del gen y, como resultado, termina la transcripción. [21]
dCas9 también demuestra ser eficaz a la hora de alterar determinadas proteínas que pueden generar enfermedades. Cuando el dCas9 se adhiere a una forma de ARN llamada ARN guía, evita la proliferación de codones repetidos y secuencias de ADN que podrían ser dañinas para el genoma de un organismo. Esencialmente, cuando se producen múltiples codones repetidos, provoca una respuesta o recluta una gran cantidad de dCas9 para combatir la sobreproducción de esos codones y da como resultado el cierre de la transcripción. dCas9 funciona sinérgicamente con el ARNg y afecta directamente a la ADN polimerasa II de la transcripción continua.
Se puede encontrar una explicación adicional de cómo funciona la proteína dCas9 en su utilización de los genomas de las plantas mediante la regulación de la producción de genes en las plantas para aumentar o disminuir ciertas características. El sistema CRISPR-CAS9 tiene la capacidad de regular hacia arriba o hacia abajo los genes. Las proteínas dCas9 son un componente del sistema CRISPR-CAS9 y estas proteínas pueden reprimir ciertas áreas de un gen vegetal. Esto sucede cuando dCAS9 se une a dominios represores y, en el caso de las plantas, se produce la desactivación de un gen regulador como AtCSTF64. [22]
Las bacterias también son otro foco del uso de proteínas dCas9. Dado que los eucariotas tienen una composición de ADN y un genoma más grandes; las bacterias mucho más pequeñas son fáciles de manipular. Como resultado, los eucariotas usan dCas9 para inhibir que la ARN polimerasa continúe el proceso de transcripción de material genético. [23]
Estudios estructurales y bioquímicos
Estructura cristalina
Cas9 presenta una arquitectura bilobulada con el ARN guía ubicado entre el lóbulo alfa helicoidal (azul) y el lóbulo de la nucleasa (cian, naranja y gris). Estos dos lóbulos están conectados a través de una única hélice de puente. Hay dos dominios de nucleasa ubicados en el lóbulo de nucleasa de múltiples dominios, el RuvC (gris) que escinde la hebra de ADN no diana y el dominio de nucleasa HNH (cian) que escinde la hebra diana de ADN. El dominio RuvC está codificado por sitios secuencialmente dispares que interactúan en la estructura terciaria para formar el dominio de escisión RuvC (ver figura de la derecha).
Una característica clave del ADN diana es que debe contener un motivo adyacente protoespaciador (PAM) que consta de la secuencia de tres nucleótidos: NGG. Este PAM es reconocido por el dominio que interactúa con PAM (dominio PI, naranja) ubicado cerca del extremo C-terminal de Cas9. Cas9 sufre distintos cambios conformacionales entre los estados de apo, guía de ARN unido y guía de ARN: ADN unido.
Cas9 reconoce la arquitectura de tallo-bucle inherente al locus CRISPR, que media en la maduración del complejo de ribonucleoproteína crRNA-tracrRNA . [25] Cas9 en complejo con CRISPR RNA (crRNA) y crRNA trans-activador (tracrRNA) reconoce y degrada aún más el dsDNA diana. [26] En la estructura cocristalina que se muestra aquí, el complejo crRNA-tracrRNA se reemplaza por un RNA quimérico de guía única (sgRNA, en rojo) que ha demostrado tener la misma función que el complejo de RNA natural. [4] La base sgRNA emparejada con el ssDNA objetivo está anclada por Cas9 como una arquitectura en forma de T. Esta estructura cristalina de la enzima Cas9 unida al ADN revela cambios conformacionales distintos en el lóbulo alfa helicoidal con respecto al lóbulo de la nucleasa, así como la ubicación del dominio HNH. La proteína consta de un lóbulo de reconocimiento (REC) y un lóbulo de nucleasa (NUC). Todas las regiones, excepto la HNH, forman estrechas interacciones entre sí y el complejo sgRNA-ssDNA, mientras que el dominio HNH forma pocos contactos con el resto de la proteína. En otra conformación del complejo Cas9 observada en el cristal, el dominio HNH no es visible. Estas estructuras sugieren la flexibilidad conformacional del dominio HNH.
Hasta la fecha, se han estudiado y publicado al menos tres estructuras cristalinas. Uno que representa una conformación de Cas9 en el estado apo, [24] y dos que representan a Cas9 en el estado unido al ADN. [27] [1]
Interacciones con sgRNA
En el complejo sgRNA-Cas9, basado en la estructura cristalina, los dominios REC1, BH y PI tienen contactos importantes con el esqueleto o las bases tanto en la región repetida como en la espaciadora. [1] [27] Se han probado varios mutantes Cas9, incluida la deleción de dominios REC1 o REC2 y mutaciones de residuos en BH. Los mutantes relacionados con REC1 y BH muestran una actividad menor o nula en comparación con el tipo salvaje, lo que indica que estos dos dominios son cruciales para el reconocimiento del sgRNA en la secuencia repetida y la estabilización de todo el complejo. Aunque las interacciones entre la secuencia espaciadora y Cas9, así como el dominio PI y la región de repetición, necesitan más estudios, el cocristal demuestra una interfaz clara entre Cas9 y sgRNA.
Escisión del ADN
El análisis de secuencia y los estudios bioquímicos previos han postulado que Cas9 contiene dos dominios nucleasa: un dominio nucleasa HNH similar a McrA y un dominio nucleasa similar a RuvC. [28] Estos dominios nucleasa HNH y tipo RuvC son responsables de la escisión de las cadenas de ADN complementarias / diana y no complementarias / no diana, respectivamente. [4] A pesar de la baja similitud de secuencia, la secuencia similar a la RNasa H tiene un pliegue RuvC (un miembro de la familia de RNasa H) y la región HNH se pliega como T4 Endo VII (un miembro de la familia de endonucleasas HNH). [ cita requerida ]
S. pyogenes Cas9 de tipo salvaje requiere cofactores de magnesio (Mg 2+ ) para la escisión del ADN mediada por ARN; sin embargo, se ha demostrado que Cas9 exhibe diferentes niveles de actividad en presencia de otros iones metálicos divalentes . [4] Por ejemplo, se ha demostrado que Cas9 en presencia de manganeso (Mn 2+ ) es capaz de escindir el ADN de forma independiente del ARN. [29] La cinética de la división del ADN por Cas9 ha sido de gran interés para la comunidad científica, ya que estos datos brindan información sobre las complejidades de la reacción. Si bien se ha demostrado que la escisión del ADN por Cas9 unido a ARN es relativamente rápida ( k ≥ 700 s −1 ), la liberación de los productos de escisión es muy lenta ( t 1/2 = ln (2) / k ≈ 43- 91 h), lo que esencialmente convierte a Cas9 en una enzima de recambio único . [30] Estudios adicionales con respecto a la cinética de Cas9 han demostrado que el Cas9 diseñado es efectivo para reducir los efectos fuera del objetivo al modificar la velocidad de la reacción. [31] [32]
Problemas que plantean las bacterias a la edición Cas9
La mayoría de las arqueas y bacterias se niegan obstinadamente a permitir que un Cas9 edite su genoma. Esto se debe a que pueden unir ADN extraño, que no les afecta, en su genoma. Otra forma en que estas células desafían a Cas9 es mediante el proceso del sistema de modificación de restricción (RM). Cuando un bacteriófago ingresa a una bacteria o célula de arqueas, es el objetivo del sistema de RM. El sistema RM luego corta el ADN de los bacteriófagos en piezas separadas mediante enzimas de restricción y usa endonucleasas para destruir aún más las hebras de ADN. Esto plantea un problema para la edición de Cas9 porque el sistema RM también se dirige a los genes extraños agregados por el proceso Cas9. [33]
Aplicaciones de Cas9 al ajuste de la transcripción
Interferencia de la transcripción por dCas9
Debido a la capacidad única de Cas9 para unirse esencialmente a cualquier secuencia del complemento en cualquier genoma , los investigadores querían usar esta enzima para reprimir la transcripción de varios loci genómicos . Para lograr esto, los dos residuos catalíticos cruciales del dominio RuvC y HNH se pueden mutar a alanina aboliendo toda la actividad endonucleasa de Cas9. La proteína resultante, denominada Cas9 'muerta' o 'dCas9' para abreviar, aún puede unirse estrechamente al dsDNA. Esta variante de Cas9 catalíticamente inactiva se ha utilizado tanto para estudios mecanicistas en la unión interrogativa de ADN Cas9 como como un complejo de proteína y ARN de unión de ADN programable general.
La interacción de dCas9 con dsDNA diana es tan estrecha que el desnaturalizante de proteína de urea de alta molaridad no puede disociar completamente el complejo dCas9 ARN-proteína del dsDNA diana. [34] dCas9 ha sido dirigido con ARN guía único diseñado para los sitios de inicio de la transcripción de cualquier loci donde dCas9 puede competir con la ARN polimerasa en los promotores para detener la transcripción. [35] Además, dCas9 puede dirigirse a la región codificante de los loci de manera que se produzca la inhibición de la ARN polimerasa durante la fase de elongación de la transcripción. [35] En eucariotas, el silenciamiento de la expresión génica se puede extender dirigiendo dCas9 a secuencias potenciadoras, donde dCas9 puede bloquear el ensamblaje de factores de transcripción que conducen al silenciamiento de la expresión génica específica. [10] Además, los ARN guía proporcionados a dCas9 pueden diseñarse para incluir desajustes específicos en su secuencia análoga complementaria que debilitarán cuantitativamente la interacción de dCas9 para su secuencia análoga programada, lo que permitirá al investigador ajustar el grado de silenciamiento de genes aplicado a un gen de interés. [35] Esta tecnología es similar en principio al ARNi, de modo que la expresión génica se modula a nivel del ARN. Sin embargo, el enfoque dCas9 ha ganado mucha tracción ya que existen menos efectos fuera del objetivo y, en general, efectos de silenciamiento más grandes y más reproducibles mediante el uso de dCas9 en comparación con las pantallas de ARNi. [36] Además, debido a que el enfoque dCas9 para el silenciamiento génico se puede controlar cuantitativamente, un investigador ahora puede controlar con precisión hasta qué punto se reprime un gen de interés, lo que permite responder a más preguntas sobre la regulación y estequiometría génica .
Más allá de la unión directa de dCas9 a posiciones de loci sensibles a la transcripción, dCas9 se puede fusionar con una variedad de dominios de proteínas moduladoras para llevar a cabo una miríada de funciones. Recientemente, dCas9 se ha fusionado con proteínas remodeladoras de cromatina (HDAC / HAT) para reorganizar la estructura de la cromatina alrededor de varios loci. [35] Esto es importante para apuntar a varios genes eucariotas de interés, ya que las estructuras de heterocromatina dificultan la unión de Cas9. Además, debido a que Cas9 puede reaccionar a la heterocromatina , se teoriza que esta enzima se puede aplicar adicionalmente para estudiar la estructura de la cromatina de varios loci. [35] Además, dCas9 se ha empleado en pantallas amplias del genoma de la represión de genes. Mediante el empleo de grandes bibliotecas de ARN guía capaces de dirigirse a miles de genes, se han realizado cribados genéticos de todo el genoma utilizando dCas9. [37]
Otro método para silenciar la transcripción con Cas9 es escindir directamente los productos de ARNm con la enzima Cas9 catalíticamente activa. [38] Este enfoque es posible mediante la hibridación de ssDNA con una secuencia del complemento de PAM a ssRNA que permite un sitio PAM de dsDNA-RNA para la unión de Cas9. Esta tecnología pone a disposición la capacidad de aislar transcripciones de ARN endógeno en células sin la necesidad de inducir modificaciones químicas en los métodos de etiquetado de ARN o ARN.
Activación de la transcripción por proteínas de fusión dCas9
A diferencia del silenciamiento de genes, dCas9 también se puede utilizar para activar genes cuando se fusiona con factores de activación de la transcripción. [35] Estos factores incluyen subunidades de la ARN polimerasa II bacteriana y factores de transcripción tradicionales en eucariotas. Recientemente, las pantallas de activación de la transcripción en todo el genoma también se han logrado utilizando fusiones de dCas9 denominadas 'CRISPRa' para la activación. [37]
Ver también
- Sistema de activación DCas9
- CRISPR
- Edición de genes CRISPR
- Edición del genoma
- Nucleasa de dedos de zinc
- Nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción
Referencias
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Otras lecturas
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enlaces externos
- Resumen de toda la información estructural disponible en el PDB para UniProt : Q99ZW2 (endonucleasa Cas9 / Csn1 asociada a CRISPR de Streptococcus pyogenes) en el PDBe-KB .