Criomicroscopía electrónica de transmisión

La criomicroscopía electrónica de transmisión ( CryoTEM ), comúnmente conocida como crio-EM , es una forma de microscopía electrónica criogénica , más específicamente un tipo de microscopía electrónica de transmisión (TEM) donde la muestra se estudia a temperaturas criogénicas (generalmente temperaturas de nitrógeno líquido ). [1] Cryo-EM está ganando popularidad en biología estructural . [2]

Imagen CryoTEM de GroEL suspendida en hielo amorfo en 50 000 × magnificación
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Estructura de la alcohol oxidasa de Pichia pastoris por CryoTEM

La utilidad de la criomicroscopía electrónica de transmisión radica en el hecho de que permite la observación de muestras que no han sido teñidas ni fijadas de ninguna forma, mostrándolas en su entorno nativo. Esto contrasta con la cristalografía de rayos X , que requiere cristalizar la muestra, que puede ser difícil, y colocarla en ambientes no fisiológicos, que ocasionalmente pueden conducir a cambios conformacionales funcionalmente irrelevantes.

Los avances en la tecnología de los detectores de electrones , en particular los DDE (Detectores directos de electrones), así como los algoritmos de generación de imágenes de software más potentes, han permitido la determinación de estructuras macromoleculares con una resolución casi atómica. [3] Las macromoléculas fotografiadas incluyen virus , ribosomas , mitocondrias , canales iónicos y complejos enzimáticos . A partir de 2018, cryo-EM podría aplicarse a estructuras tan pequeñas como la hemoglobina (64 kDa ) [4] y con resoluciones de hasta 1.8 Å . [5] En 2019, las estructuras crio-EM representaron el 2,5% de las estructuras depositadas en el banco de datos de proteínas , [6] y este número sigue creciendo. [7] Una aplicación de cryo-EM es la tomografía crioelectrónica (cryo-ET), donde se crea una reconstrucción 3D de la muestra a partir de imágenes 2D inclinadas.

El fundamento original de CryoTEM fue como un medio para combatir el daño por radiación de las muestras biológicas. La cantidad de radiación requerida para recolectar una imagen de una muestra en el microscopio electrónico es lo suficientemente alta como para ser una fuente potencial de daño de la muestra para estructuras delicadas. Además, el alto vacío requerido en la columna de un microscopio electrónico hace que el entorno de la muestra sea bastante hostil.

El problema del vacío se resolvió parcialmente mediante la introducción de tinciones negativas, pero incluso con tinciones negativas, las muestras biológicas son propensas al colapso estructural tras la deshidratación de la muestra. Incrustar las muestras en hielo por debajo de la temperatura de sublimación era una posibilidad que se contempló desde el principio, pero el agua tiende a organizarse en una red cristalina de menor densidad al congelarse y esto puede destruir la estructura de cualquier cosa que esté incrustada en ella.

A principios de la década de 1980, varios grupos que estudiaban la física del estado sólido intentaban producir hielo vítreo por diferentes medios, como la congelación a alta presión o la congelación instantánea. En un artículo fundamental en 1984, el grupo dirigido por Jacques Dubochet en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular mostró imágenes de adenovirus incrustados en una capa vitrificada de agua. [8] En general, se considera que este artículo marca el origen de Cryo-EM, y la técnica se ha desarrollado hasta el punto de convertirse en una rutina en numerosos laboratorios de todo el mundo.

La energía de los electrones utilizados para la formación de imágenes (80-300 kV) es lo suficientemente alta como para romper los enlaces covalentes . Cuando las muestras de imágenes son vulnerables al daño por radiación, es necesario limitar la exposición a los electrones utilizados para adquirir la imagen. Estas bajas exposiciones requieren que las imágenes de miles o incluso millones de moléculas congeladas idénticas se seleccionen, alineen y promedien para obtener mapas de alta resolución, utilizando software especializado. En 2012 se logró una mejora significativa en las características estructurales mediante la introducción de detectores de electrones directos y mejores algoritmos computacionales. [1] [2]

En 2015, Bridget Carragher y sus colegas del Scripps National Resource for Automated Molecular Microscopy utilizaron técnicas que ella y Clint Potter desarrollaron para determinar la primera estructura crio-EM con una resolución más fina que 3 Å, elevando así a CryoTEM como una herramienta comparable y potencialmente superior. a las técnicas tradicionales de cristalografía de rayos X. [9] [10] Desde entonces, se han logrado resoluciones más altas, incluida una estructura de 2,2 Å de la enzima bacteriana β-galactosidasa en 2015 [11] y una estructura de 1,8 Å de glutamato deshidrogenasa en 2016. [12] Cryo-EM también ha se ha utilizado para determinar la estructura de varios virus, incluido el virus Zika , [13] y se ha aplicado a complejos grandes como el espliceosoma . [14] En 2017, el Premio Nobel de Química fue otorgado conjuntamente a Jacques Dubochet , Joachim Frank y Richard Henderson , "por desarrollar microscopía crioelectrónica para la determinación de estructuras de alta resolución de biomoléculas en solución". [15]

Película delgada

El material biológico se esparce en una rejilla de microscopía electrónica y se conserva en un estado hidratado congelado por congelación rápida, generalmente en etano líquido cerca de la temperatura del nitrógeno líquido . Manteniendo las muestras a la temperatura del nitrógeno líquido o más frías, se pueden introducir en el alto vacío de la columna del microscopio electrónico . La mayoría de las muestras biológicas son extremadamente radiosensibles , por lo que deben obtenerse imágenes con técnicas de dosis baja (de manera útil, la criomicroscopía electrónica de transmisión a baja temperatura proporciona un factor de protección adicional contra el daño por radiación).

En consecuencia, las imágenes son extremadamente ruidosas . Para algunos sistemas biológicos, es posible promediar imágenes para aumentar la relación señal-ruido y recuperar información de alta resolución sobre la muestra utilizando la técnica conocida como análisis de partículas individuales . Este enfoque en general requiere que las cosas que se promedien sean idénticas, aunque ahora se puede estudiar alguna heterogeneidad conformacional limitada (por ejemplo, ribosoma ). Las reconstrucciones tridimensionales a partir de imágenes CryoTEM de complejos de proteínas y virus se han resuelto a una resolución subnanométrica o casi atómica, lo que permite nuevos conocimientos sobre la estructura y la biología de estos grandes conjuntos.

El análisis de matrices ordenadas de proteínas, como cristales 2-D de proteínas transmembrana o matrices helicoidales de proteínas, también permite una especie de promediado que puede proporcionar información de alta resolución sobre la muestra. Esta técnica se llama cristalografía electrónica .

Secciones vítreas

El método de película fina se limita a muestras delgadas (normalmente <500 nm) porque los electrones no pueden atravesar muestras más gruesas sin múltiples eventos de dispersión. Las muestras más gruesas se pueden vitrificar mediante congelación por inmersión ( criofijación ) en etano (hasta decenas de μm de espesor) o, más comúnmente, mediante congelación a alta presión (hasta cientos de μm). Luego se pueden cortar en secciones delgadas (de 40 a 200 nm de espesor) con un cuchillo de diamante en un crioultramicrotomo a temperaturas inferiores a -135 ° C (temperatura de desvitrificación). Las secciones se recogen en una rejilla de microscopio electrónico y se obtienen imágenes de la misma manera que la muestra vitrificada en película delgada. Esta técnica se denomina criomicroscopía electrónica de transmisión de secciones vítreas (CEMOVIS) o criomicroscopía electrónica de transmisión de secciones hidratadas congeladas.

Además de permitir la obtención de imágenes de muestras biológicas vitrificadas, CryoTEM también se puede utilizar para obtener imágenes de muestras de material que son demasiado volátiles en el vacío para obtener imágenes mediante microscopía electrónica estándar a temperatura ambiente. Por ejemplo, las secciones vitrificadas de las interfaces líquido-sólido se pueden extraer para su análisis mediante CryoTEM, [16] y el azufre, que es propenso a la sublimación en el vacío de los microscopios electrónicos, se puede estabilizar y obtener imágenes en CryoTEM. [17]

Se pueden utilizar una variedad de técnicas en CryoTEM. [18] Las técnicas populares incluyen:

  1. Cristalografía electrónica
    1. Análisis de cristales bidimensionales
    2. Análisis de tubos o filamentos helicoidales
    3. Difracción de electrones de microcristales (MicroED) [19] [20] [21] [22]
  2. Análisis de partículas individuales (SPA)
    1. CryoTEM de resolución temporal [23] [24] [25]
  3. Criotomografía electrónica (cryoET)

  • Microscopía electrónica de barrido criogénico
  • Banco de datos de EM
  • Resolución (densidad de electrones)
  • Análisis de partículas individuales

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  • Introducción a Cryo-EM : curso en línea de Caltech, profesor Grant Jensen
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