Pichia pastoris es una especie de levadura metilotrófica . Fue encontrado en la década de 1960, con su característica de utilizar metanol , como fuente de carbono y energía. [1] Después de años de estudio, P. pastoris fue ampliamente utilizado enlas industrias de investigación bioquímica y biotecnología . Con un gran potencial para ser un sistema de expresión para la producción de proteínas , además de ser un organismo modelo para el estudio genético, P. pastoris se ha vuelto importante para la investigación biológica y las aplicaciones biotecnológicas. En la última década, algunos informes reasignaron P. pastoris al géneroKomagataella con análisis filogenético , mediante secuenciación del genoma de P. pastoris . La especie se dividió en K. phaffii , K. pastoris y K. pseudopastoris . [2] [3]
Pichia pastoris | |
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Especies: | pastoris |
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Pichia pastoris |
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P. pastoris en la naturaleza
Hábitat natural
Naturalmente, P. pastoris vive en árboles, como los castaños . Son heterótrofos y pueden usar varias fuentes de carbono para vivir, como glucosa , glicerol y metanol . [4] Sin embargo, no pueden usar lactosa .
Reproducción
P. pastoris puede sufrir tanto la reproducción asexual y sexual, reproducción, por ciernes y ascosporas . [5] En este caso, existen dos tipos de células de P. pastoris : células haploides y diploides . En el ciclo de vida asexual , las células haploides experimentan mitosis para la reproducción. En el ciclo de vida sexual, las células diploides sufren esporulación y meiosis . [6] La tasa de crecimiento de sus colonias puede variar en un amplio rango, desde cerca de 0 hasta un tiempo de duplicación de una hora, lo que es adecuado para procesos industriales. [7]
P. pastoris como organismo modelo
En los últimos años, P. pastoris fue investigado e identificado como un buen organismo modelo con varias ventajas. En primer lugar, P. patoris se puede cultivar y utilizar fácilmente en el laboratorio. Al igual que otros modelos de levadura ampliamente utilizados, tiene una vida útil relativamente corta y un tiempo de regeneración rápido. Además, se han diseñado algunos medios de cultivo económicos, de modo que P. patoris pueda crecer rápidamente en ellos, con alta densidad celular. [8] Se había realizado la secuenciación del genoma completo de P. patoris . El genoma de P. pastoris GS115 ha sido secuenciado por el Instituto Flanders de Biotecnología y la Universidad de Ghent, y publicado en Nature Biotechnology . [9] La secuencia del genoma y la anotación de genes se pueden examinar a través del sistema ORCAE . Los datos genómicos completos permiten a los científicos identificar proteínas homólogas y relaciones evolutivas entre otras especies de levadura y P. pastoris . Además, P. pastoris son células eucariotas individuales, lo que significa que los investigadores podrían investigar las proteínas dentro de P. pastoris . Luego se puede procesar la comparación homóloga con otras especies eucariotas más complicadas, para obtener sus funciones y orígenes. [10]
Otra ventaja de P. pastoris es su similitud con el modelo de levadura bien estudiado: Saccharomyces cerevisiae . Como organismo modelo para la biología, S. cerevisiae ha sido bien estudiado durante décadas y utilizado por investigadores para diversos fines a lo largo de la historia. Los dos géneros de levadura; Pichia y Saccharomyces , tienen condiciones de crecimiento y tolerancias similares; por tanto, los laboratorios pueden adoptar el cultivo de P. pastoris sin muchas modificaciones. [11] Además, a diferencia de S. cerevisiae , P. pastoris tiene la capacidad de procesar funcionalmente proteínas con gran peso molecular, lo que es útil en un hospedador traduccional. [12] Teniendo en cuenta todas las ventajas, P. pastoris puede emplearse de manera útil como organismo modelo tanto genético como experimental.
P. pastoris como organismo modelo genético
Como organismo modelo genético, P. pastoris se puede utilizar para análisis genéticos y cruces genéticos a gran escala , con datos genómicos completos y su capacidad para llevar a cabo un procesamiento genético eucariota complejo en un genoma relativamente pequeño. Los genes funcionales para el ensamblaje de peroxisomas se investigaron comparando cepas de tipo salvaje y mutantes de P. pastoris . [13]
P. pastoris como organismo modelo experimental
Como organismo modelo experimental, P. pastoris se utilizó principalmente como sistema huésped para la transformación. Debido a su capacidad de recombinación con ADN extraño y procesamiento de proteínas grandes, se han realizado muchas investigaciones para investigar la posibilidad de producir nuevas proteínas y la función de proteínas diseñadas artificialmente, utilizando P. pastoris como hospedador de transformación. [14] En la última década, P. pastoris fue diseñado para construir plataformas de sistemas de expresión , que es una aplicación típica para un organismo modelo experimental estándar, como se describe a continuación.
P. pastoris como plataforma de sistema de expresión
P. pastoris se utiliza con frecuencia como sistema de expresión para la producción de proteínas heterólogas . Varias propiedades hacen que P. pastoris sea adecuado para esta tarea. Actualmente, varias cepas de P. pastoris se utilizan con fines biotecnológicos, con diferencias significativas entre ellas en el crecimiento y la producción de proteínas. [15] Algunas variantes comunes poseen una mutación en el gen HIS4 , lo que lleva a la selección de células que se transforman con éxito con vectores de expresión . La tecnología para la integración del vector en el genoma de P. pastoris es similar a la de Saccharomyces cerevisiae . [dieciséis]
Ventaja
1: P. pastoris puede crecer en un medio simple y económico, con una alta tasa de crecimiento. P. pastoris puede crecer en matraces agitados o en un fermentador , lo que lo hace adecuado para la producción tanto a pequeña como a gran escala. [17]
2: P. pastoris tiene dos genes de alcohol oxidasa , Aox1 y Aox2 , que incluyen promotores fuertemente inducibles . [18] Estos dos genes permiten a Pichia utilizar metanol como fuente de carbono y energía. Los promotores AOX son inducidos por metanol y reprimidos por glucosa . Normalmente, el gen de la proteína deseada se introduce bajo el control del promotor Aox1 , lo que significa que la producción de proteínas puede inducirse mediante la adición de metanol en el medio. Después de varias investigaciones, los científicos encontraron que el promotor derivado del gen AOX1 en P. pastoris es extremadamente adecuado para controlar la expresión de genes extraños, que se habían transformado en el genoma de P. pastoris , produciendo proteínas heterólogas. [19]
3: Con un rasgo clave , P. pastoris puede crecer con una densidad celular extremadamente alta en el cultivo. Esta característica es compatible con la expresión de proteínas heterólogas, dando mayores rendimientos de producción. [20]
4: La tecnología requerida para la manipulación genética de P. pastoris es similar a la de Saccharomyces cerevisiae , que es uno de los organismos modelo de levadura mejor estudiados. Como resultado, el protocolo y los materiales del experimento son fáciles de construir para P. pastoris . [21]
Desventaja
Como algunas proteínas requieren chaperonina para un plegamiento adecuado, Pichia no puede producir varias proteínas, ya que P. pastoris no contiene las chaperonas adecuadas. Las tecnologías para introducir genes de chaperoninas de mamíferos en el genoma de la levadura y sobreexpresar las chaperoninas existentes aún requieren mejoras. [22] [23]
Comparación con otros sistemas de expresión
En la investigación de biología molecular estándar , la bacteria Escherichia coli es el organismo más utilizado para el sistema de expresión, para producir proteínas heterólogas , debido a sus características de rápida tasa de crecimiento, alta tasa de producción de proteínas y condiciones de crecimiento poco exigentes. La producción de proteínas en E. coli suele ser más rápida que en P. pastoris , por razones: las células de E. coli competentes se pueden almacenar congeladas y descongeladas antes de su uso, mientras que las células de Pichia deben producirse inmediatamente antes de su uso. Los rendimientos de expresión en Pichia varían entre diferentes clones , por lo que es necesario seleccionar un gran número de clones para determinar la producción de proteínas para encontrar el mejor productor. La mayor ventaja de Pichia sobre E. coli es que Pichia es capaz de formar enlaces disulfuro y glicosilaciones en proteínas, pero E. coli no puede. [24] E. coli puede producir una proteína mal plegada cuando se incluyen disulfuros en el producto final, lo que da lugar a formas inactivas o insolubles de proteínas. [25]
El bien estudiado Saccharomyces cerevisiae también se usa como un sistema de expresión con ventajas similares sobre E. coli como Pichia . Sin embargo, Pichia tiene dos ventajas principales sobre S. cerevisiae en entornos industriales y de laboratorio:
- Pichia , como se mencionó anteriormente, es un metilótrofo , lo que significa que puede crecer con metanol simple, como única fuente de energía; Pichia puede crecer rápidamente en suspensión celular con una solución de metanol razonablemente fuerte, que mataría a la mayoría de los demás microorganismos. En este caso, el sistema de expresión es económico de configurar y mantener.
- Pichia puede crecer hasta una densidad celular muy alta. En condiciones ideales, puede multiplicarse hasta el punto en que la suspensión celular sea prácticamente una pasta. Como el rendimiento de proteína del sistema de expresión en un microbio es aproximadamente igual al producto de las proteínas producidas por célula, lo que hace que Pichia sea de gran utilidad cuando se trata de producir grandes cantidades de proteína sin equipos costosos. [24]
En comparación con otros sistemas de expresión, como las células S2 de Drosophila melanogaster y las células de ovario de hámster chino , Pichia suele ofrecer rendimientos mucho mejores. Generalmente, las líneas celulares de organismos multicelulares requieren tipos de medios complejos y costosos, que incluyen aminoácidos , vitaminas y otros factores de crecimiento . Estos tipos de medios aumentan significativamente el costo de producción de proteínas heterólogas. Además, dado que Pichia puede crecer en medios que contienen solo una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno , lo que es adecuado para aplicaciones de marcado isotópico, como la proteína NMR . [24]
Aplicaciones industriales
P. pastoris se ha utilizado en varios tipos de industrias biotecnológicas, como la industria farmacéutica . Todas las aplicaciones se basan en su característica de expresar proteínas.
Producción bioterapéutica
En los últimos años, Pichia pastoris se ha utilizado para la producción de más de 500 tipos de bioterapéuticos , como el IFNγ . Al principio, un inconveniente de este sistema de expresión de la proteína es el exceso de glicosilación con alta densidad de manosa estructura, que es una causa potencial de inmunogenicidad . [26] [27] En 2006, un grupo de investigación logró crear una nueva cepa llamada YSH597. Esta cepa puede expresar eritropoyetina en su forma de glicosilación normal, intercambiando las enzimas responsables de la glicosilación de tipo fúngico, con los homólogos de mamíferos. Por tanto, el patrón de glicosilación alterado permitió que la proteína fuera completamente funcional. [28]
Producción de enzimas para la industria alimentaria
En industrias alimentarias, como cervecerías y panaderías, Pichia pastoris se utiliza para producir diferentes tipos de enzimas, como coadyuvantes de procesamiento y aditivos alimentarios , con muchas funciones. Por ejemplo, algunas enzimas producidas por Pichia pastoris modificada genéticamente pueden mantener el pan suave. Mientras tanto, en la cerveza, las enzimas podrían usarse para reducir la concentración de alcohol. [29]
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