Cyanidioschyzon merolae es un alga roja haploide unicelular unicelular, pequeña (2μm),adaptada a ambientes de aguas termales ácidos con alto contenido de azufre (pH 1.5, 45 ° C). [2] [3] La arquitectura celular de C. merolae es extremadamente simple, contiene un solo cloroplasto y una sola mitocondria y carece de vacuola y pared celular . [4] Además, lasdivisionescelulares y orgánulos se pueden sincronizar. Por estas razones, C. merolae se considera un excelente sistema modelo para el estudio de los procesos de división celular y de orgánulos, así comobioquímica y biología estructural . [5] [6] [7] El genoma del organismo fue el primer genoma completo de algas secuenciado en 2004; [8] su plastidio fue secuenciado en 2000 y 2003, y su mitocondria en 1998. [9] El organismo ha sido considerado la más simple de las células eucariotas por su organización celular minimalista. [10]
Cyanidioschyzon | |
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clasificación cientifica | |
(no clasificado): | Archaeplastida |
División: | Rhodophyta |
Clase: | Cyanidiophyceae |
Pedido: | Cyanidiales |
Familia: | Cyanidiaceae |
Género: | Cyanidioschyzon |
Especies: | C. merolae |
Nombre binomial | |
Cyanidioschyzon merolae P. De Luca, R.Taddei y L.Varano, 1978 [1] |
Aislamiento y crecimiento en cultivo.
Aislado originalmente por De Luca en 1978 a partir de los solfatane fumaroles de Campi Flegrei ( Nápoles, Italia ), [2] C. merolae se puede cultivar en cultivo en el laboratorio en medio modificado de Allen (MA) [7] o una forma modificada con dos veces la concentración de algunos elementos llamados MA2. [10] [12] Con el medio MA, las tasas de crecimiento no son particularmente rápidas, con un tiempo de duplicación (el tiempo que tarda un cultivo de microbios en duplicar las células por unidad de volumen) de aproximadamente 32 horas. [7] Al utilizar el medio MA2 más óptimo, esto se puede reducir a 24 horas. [7] El cultivo se realiza a 42 ° C bajo luz fluorescente blanca con una intensidad aproximada de 50 µmol de fotones m -2 s -1 (µE). [10] Sin embargo, bajo una intensidad de luz más alta de 90 µE con 5% de CO 2 aplicado mediante burbujeo, la tasa de crecimiento de C. merolae puede incrementarse aún más, con un tiempo de duplicación de aproximadamente 9.2 horas. [7] Una luz más alta no es necesariamente beneficiosa, ya que por encima de 90 µE la tasa de crecimiento comienza a disminuir. [7] Esto puede deberse al fotodaño que se produce en el aparato fotosintético. C. merolae también se puede cultivar en placas de goma gellan con fines de selección de colonias o mantenimiento de cepas en el laboratorio. [7] C. merolae es un fotótrofo oxigenado obligado , lo que significa que no es capaz de absorber carbono fijo de su entorno y debe depender de la fotosíntesis oxigenada para fijar el carbono del CO 2 . [10]
Genoma
El genoma de 16,5 mega pares de bases de C. merolae se secuenció en 2004. [3] El genoma reducido, extremadamente simple y compacto está formado por 20 cromosomas y se encontró que contenía 5.331 genes, de los cuales se encontró que el 86,3% se expresaban y solo 26 contienen intrones , que contienen secuencias de consenso estrictas. [3] Sorprendentemente, el genoma de C. merolae contiene solo 30 genes de ARNt y un número extremadamente mínimo de copias de genes de ARN ribosómico , [3] como se muestra en la tabla de comparación del genoma . La naturaleza reducida del genoma ha dado lugar a varias otras características inusuales. Si bien la mayoría de los eucariotas contienen aproximadamente 10 copias de las dinaminas necesarias para pellizcar las membranas para separar los compartimentos divisorios, C. merolae solo contiene dos, [3] un hecho que los investigadores han aprovechado al estudiar la división de orgánulos.
Aunque posee un genoma pequeño, [8] el genoma del cloroplasto de C. merolae contiene muchos genes que no están presentes en los genomas del cloroplasto de otras algas y plantas. [13] La mayoría de sus genes carecen de intrones. [8]
Biología Molecular
Como es el caso de la mayoría de los organismos modelo, se han desarrollado herramientas genéticas en C. merolae . Estos incluyen métodos para el aislamiento de ADN y ARN de C. merolae , la introducción de ADN en C. merolae para transformación transitoria o estable, y métodos de selección que incluyen un auxótrofo de uracilo que puede usarse como marcador de selección.
Aislamiento de ADN
Se utilizan varios métodos, derivados de protocolos de cianobacterias , para el aislamiento de ADN de C. merolae . [10] [14] La primera es una extracción con fenol caliente , que es una extracción rápida que se puede utilizar para aislar ADN adecuado para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de amplificación de ADN , [10] [15] en la que se agrega fenol a células completas y se incubó a 65 ° C para extraer el ADN. [10] Si se requiere ADN más puro, se puede emplear el método de bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB). En este método, primero se aplica un tampón de extracción con alto contenido de sal y se rompen las células, después de lo cual se usa una mezcla de cloroformo y fenol para extraer el ADN a temperatura ambiente. [10]
Aislamiento de ARN
El ARN total se puede extraer de las células de C. merolae usando una variante del método de fenol caliente descrito anteriormente para el ADN. [10]
Extracción de proteínas
Como ocurre con el ADN y el ARN, el protocolo de extracción de proteínas también es una adaptación del protocolo utilizado en cianobacterias. [10] [16] Las células se rompen con perlas de vidrio y se agitan en un tampón de glicerol al 10% que contiene el agente reductor DTT para romper los enlaces disulfuro dentro de las proteínas. [10] Esta extracción dará como resultado proteínas desnaturalizadas , que se pueden utilizar en geles SDS-PAGE para Western Blot y tinción de Coomassie .
Selección transformante y línea auxotrófica de uracilo
C. merolae es sensible a muchos antibióticos que se utilizan comúnmente para la selección de individuos transformados con éxito en el laboratorio, pero es resistente a algunos, en particular a la ampicilina y la kanamicina . [7] [17]
Un marcador de selección de uso común para la transformación en C. merolae implica un auxótrofo de uracilo (que requiere uracilo exógeno). El mutante se desarrolló cultivando C. merolae en presencia de un compuesto, 5-FOA, que en sí mismo no es tóxico, pero se convierte en el compuesto tóxico 5-fluorouracilo por una enzima en la vía biosintética del uracilo, orotidina 5. '-monofosfato (OMP) descarboxilasa , codificada por el gen Ura5.3 . [7] La mutación aleatoria llevó a varios mutantes con pérdida de función en Ura5.3 , lo que permitió que las células sobrevivieran en presencia de 5-FOA siempre que se proporcionara uracilo. [7] Al transformar este mutante con un fragmento de PCR que lleva tanto un gen de interés como una copia funcional de Ura5.3 , los investigadores pueden confirmar que el gen de interés se ha incorporado al genoma de C. merolae si puede crecer sin uracilo exógeno. .
Expresión transitoria mediada por polietilenglicol (PEG)
Si bien la integración cromosómica de genes crea un transformante estable, la expresión transitoria permite realizar experimentos a corto plazo utilizando genes marcados o modificados en C. merolae . La expresión transitoria se puede lograr usando un método basado en polietilenglicol (PEG) en protoplastos (células vegetales con la pared celular rígida eliminada enzimáticamente), y debido a que C. merolae carece de pared celular, se comporta de manera similar a un protoplasto para fines de transformación. [12] Para transformar, las células se exponen brevemente a PEG al 30% con el ADN de interés, lo que resulta en una transformación transitoria. [12] En este método, el ADN se toma como un elemento circular y no se integra en el genoma del organismo porque no existen regiones homólogas para la integración.
Orientación genética
Para crear una línea mutante estable, se puede usar el direccionamiento de genes para insertar un gen de interés en una ubicación particular del genoma de C. merolae mediante recombinación homóloga . Al incluir regiones de ADN de varios cientos de pares de bases de largo en los extremos del gen de interés que son complementarias a una secuencia dentro del genoma de C. merolae , se puede utilizar la propia maquinaria de reparación del ADN del organismo para insertar el gen en estas regiones. [18] Aquí se puede utilizar el mismo procedimiento de transformación que se utiliza para la expresión transitoria, excepto con los segmentos de ADN homólogos para permitir la integración del genoma. [18]
Estudiar las divisiones de células y orgánulos
El divisoma extremadamente simple, la arquitectura celular simple y la capacidad de sincronizar divisiones en C. merolae lo convierten en el organismo perfecto para estudiar los mecanismos de división de células eucariotas y orgánulos. [3] [6] La sincronización de la división de orgánulos en células cultivadas puede ser muy simple y generalmente implica el uso de ciclos de luz y oscuridad. El agente químico afidicolina se puede agregar para sincronizar fácil y eficazmente la división del cloroplasto. [19] El mecanismo de división de peroxisomas se determinó por primera vez utilizando C. merolae como sistema, [20] donde la división de peroxisomas se puede sincronizar utilizando el fármaco oryzalin, que interrumpe los microtúbulos, además de los ciclos de luz-oscuridad. [20]
Investigación de la fotosíntesis
C. merolae también se utiliza en la investigación de la fotosíntesis . En particular, la composición de subunidades de los fotosistemas en C. merolae tiene algunas diferencias significativas con la de otros organismos relacionados. [21] [22] El fotosistema II (PSII) de C. merolae , como era de esperar, tiene un rango de pH particularmente inusual en el que puede funcionar. [21] [23] A pesar de que el mecanismo de PSII requiere que los protones se liberen rápidamente, y las soluciones de pH más bajo deberían alterar la capacidad de hacer esto, C. merolae PSII es capaz de intercambiar y dividir agua al mismo ritmo que otros especies relacionadas. [21]
Ver también
- Galdieria sulphuraria
- alga roja
enlaces externos
- Proyecto Genoma Cyanidioschyzon merolae
Guiry, MD; Guiry, GM (2008). "' Cyanidioschyzon merolae' " . AlgaeBase . Publicación electrónica mundial, Universidad Nacional de Irlanda, Galway.
Referencias
- ^ «Cyanidioschyzon merolae»: una nueva alga de ambientes ácidos térmicos. P De Luca, R Taddei y L Varano, Webbia, 1978
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