La activación de CRISPR (CRISPRa) es un tipo de herramienta CRISPR que utiliza versiones modificadas de efectores CRISPR sin actividad endonucleasa , con activadores transcripcionales agregados en dCas9 o los ARN guía (gRNA) . Al igual que para la interferencia CRISPR , el efector CRISPR es guiado al objetivo por un ARN guía complementario. Sin embargo, los sistemas de activación CRISPR se fusionan con activadores transcripcionales para aumentar la expresión de genes de interés. Dichos sistemas se pueden utilizar para muchos propósitos que incluyen, pero no se limitan a, cribados genéticos y sobreexpresión de proteínas de interés. El efector más utilizado se basa en Cas9 (de sistemas Tipo II), pero también se han utilizado otros efectores como Cas12a (Tipo V). [1]
Componentes
dCas9
Cas9 Endonuclease Dead, también conocida como Dead Cas9 o dCas9 , es una forma mutante de Cas9 cuya actividad endonucleasa se elimina a través de mutaciones puntuales en sus dominios de endonucleasa. Similar a su forma no mutada, dCas9 se usa en sistemas CRISPR junto con gRNA para apuntar a genes específicos o nucleótidos complementarios al gRNA con secuencias PAM que permiten que Cas9 se una. Cas9 normalmente tiene 2 dominios de endonucleasa llamados dominios RuvC y HNH. Las mutaciones puntuales D10A y H840A cambian 2 residuos importantes para la actividad endonucleasa que finalmente resulta en su desactivación. Aunque dCas9 carece de actividad endonucleasa, todavía es capaz de unirse a su ARN guía y a la cadena de ADN a la que se dirige porque dicha unión es gestionada por otros dominios. Esto por sí solo suele ser suficiente para atenuar, si no bloquear por completo, la transcripción del gen objetivo si el ARNg posiciona dCas9 de una manera que evita que los factores de transcripción y la ARN polimerasa accedan al ADN. Sin embargo, esta capacidad para unirse al ADN también puede aprovecharse para la activación, ya que dCas9 tiene regiones modificables, típicamente los extremos N y C de la proteína, que pueden usarse para unir activadores transcripcionales. [2]
ARN guía
Un pequeño ARN guía ( sgRNA ) o gRNA es un ARN con alrededor de 20 nucleótidos que se utilizan para dirigir Cas9 o dCas9 a sus objetivos. Los ARNg contienen dos regiones principales de importancia para los sistemas CRISPR: las regiones de andamio y espaciador. La región espaciadora tiene nucleótidos que son complementarios a los que se encuentran en los genes diana, a menudo en la región promotora . La región del andamio es responsable de la formación de un complejo con (d) Cas9. Juntos, unen (d) Cas9 y lo dirigen al gen o genes de interés. Dado que la región espaciadora de un ARNg puede modificarse para cualquier secuencia potencial, dan a los sistemas CRISPR mucha más flexibilidad, ya que cualquier gen y nucleótido con una secuencia complementaria a la región espaciadora puede convertirse en posibles objetivos. [2]
![Complementary base pairing between the sgRNA and genomic DNA allows targeting of Cas9 or dCas9](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/c/cc/Schematic_Structure_of_the_Cas9-sgRNA-DNA_Ternary_Complex.svg/444px-Schematic_Structure_of_the_Cas9-sgRNA-DNA_Ternary_Complex.svg.png)
Activadores transcripcionales
Ver: activador transcripcional , factor de transcripción
Los activadores transcripcionales son dominios de proteínas o proteínas completas unidas a dCas9 o sgRNA que ayudan en el reclutamiento de cofactores importantes, así como de la ARN polimerasa para la transcripción de los genes a los que se dirige el sistema. Para que una proteína se produzca a partir del gen que la codifica, la ARN polimerasa debe producir ARN a partir de la plantilla de ADN del gen durante un proceso llamado transcripción. Los activadores transcripcionales tienen un dominio de unión al ADN y un dominio para la activación de la transcripción. El dominio de activación puede reclutar factores de transcripción generales o ARN polimerasa en la secuencia del gen. Los dominios de activación también pueden funcionar facilitando la transcripción por ARN polimerasas estancadas, y en eucariotas pueden actuar para mover nucleosomas en el ADN o modificar histonas para aumentar la expresión génica. [3] Estos activadores pueden introducirse en el sistema mediante la unión a dCas9 o al sgRNA. Algunos investigadores han observado que el grado de regulación positiva de la transcripción se puede modular mediante el uso de múltiples sitios para la unión del activador en un experimento y mediante el uso de diferentes variaciones y combinaciones de activadores a la vez en un experimento o muestra determinados. [4] [5] [6]
Sistema de expresión
Se requiere un sistema de expresión para la introducción de los gRNA y (d) proteínas Cas9 en las células de interés. Las opciones empleadas típicamente incluyen, pero no se limitan a, plásmidos y vectores virales tales como vector de virus adenoasociado (AAV) o vector de lentivirus .
Sistemas de activación específicos
VP64-p65-Rta
El activador dCas9 VP64-p65-Rta, o VPR, se creó modificando un activador dCas9 existente, en el que un activador transcripcional Vp64 se une al término C de dCas9. En la proteína dCas9-VPR, los factores de transcripción p65 y Rta se agregan al término C de dCas9-Vp64. Por lo tanto, los tres factores de transcripción están dirigidos al mismo gen. El uso de tres factores de transcripción, a diferencia de Vp64 únicamente, da como resultado una mayor expresión de genes diana. Cuando diferentes genes fueron dirigidos por dCas9, todos mostraron una expresión significativamente mayor con dCas9-VPR que con dCas9-VP64. También se ha demostrado que dCas9-VPR puede usarse para aumentar la expresión de múltiples genes dentro de la misma célula colocando múltiples sgRNA en la misma célula. [7] dCas9-VPR se ha utilizado para activar los genes de neurogenina 2 (enlace) y diferenciación neurogénica 1 (enlace), lo que resulta en la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas en neuronas inducidas . [7] Un estudio que comparó los activadores dCas9 encontró que los activadores VPR, SAM y Suntag funcionaban mejor con dCas9 para aumentar la expresión génica en una variedad de tipos de células de moscas de la fruta , ratones y humanos . [8]
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/4/4e/DCas9-VPR_activator.svg/220px-DCas9-VPR_activator.svg.png)
Mediador de activación sinérgico
Para superar la limitación del sistema de activación del gen dCas9-VP64, se desarrolló el sistema dCas9-SAM para incorporar múltiples factores de transcripción. Utilizando las proteínas MS2 , p65 y HSF1 , el sistema dCas9-SAM recluta varios factores transcripcionales que trabajan sinérgicamente para activar el gen de interés.
![](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/2/22/DCas_SAM_system.png/220px-DCas_SAM_system.png)
Para ensamblar diferentes activadores transcripcionales, el sistema dCas9-SAM utiliza un ARN guía único modificado (ARNsg) que tiene sitios de unión para la proteína MS2. Los aptámeros de horquilla se unen al tetrabucle y al tallo bucle 2 del sgRNA para convertirse en sitios de unión para las proteínas de la cubierta del bacteriófago MS2 dimerizado. Como las horquillas están expuestas fuera del complejo dCas9-sgRNA, otros factores de transcripción pueden unirse a la proteína MS2 sin alterar el complejo dCas9-sgRNA. Por tanto, la proteína MS2 está diseñada para incluir proteínas p65 y HSF1. La proteína de fusión MS2-p65-HSF1 interactúa con dCas9-VP64 para reclutar más factores de transcripción en el promotor de los genes diana.
Empleando el sistema dCas-SAM, Zhang et al. (2015) reactivaron con éxito el gen latente del VIH para sobreexpresar proteínas virales de las células huésped del VIH. [9] Fueron capaces de sobreexpresar proteínas virales sustancialmente para desencadenar la apoptosis de las células latentes del VIH-1 debido a la toxicidad de las proteínas virales. En otro experimento del sistema dCas-SAM, Konermann et al. (2015) encontraron genes en células de melanoma que dan resistencia a un inhibidor de BRAF mediante la activación de genes candidatos a través del sistema dCas. [6] Por lo tanto, el sistema dCas9-SAM puede emplearse además para activar genes latentes, desarrollar terapias génicas y descubrir nuevos genes.
SunTag
El sistema activador SunTag utiliza la proteína dCas9, que se modifica para vincularse con SunTag. SunTag es una matriz de polipéptidos repetidos que puede reclutar múltiples copias de anticuerpos . Mediante la unión de factores de transcripción a los anticuerpos, el complejo activador SunTag dCas9 amplifica su reclutamiento de factores de transcripción. Para guiar la proteína dCas9 a su gen objetivo, el sistema dCas9 SunTag utiliza sgRNA .
A Tanenbaum et al. (2014) se les atribuye la creación del sistema dCas9 SunTag. Para los anticuerpos , emplearon anticuerpos GCN4 que se unieron al factor de transcripción VP64. Para transportar los anticuerpos a los núcleos de las células, adjuntaron la etiqueta NLS . Para confirmar la localización nuclear de los anticuerpos, se utilizó sfGFP con fines de visualización. Por lo tanto, la proteína GCN4-sfGFP-NLS-VP64 fue desarrollada para interactuar con el sistema dCas SunTag. Los anticuerpos se unieron con éxito a los polipéptidos SunTag y activaron el gen CXCR4 diana en las líneas celulares K562. [10] En comparación con el complejo de activación dCas9-VP64, pudieron aumentar la expresión del gen CXCR4 entre 5 y 25 veces más en las líneas celulares K562. No solo hubo una mayor sobreexpresión de la proteína CXCR4, sino que también las proteínas CXCR4 estuvieron activas para viajar más en el ensayo de migración transwell. Por tanto, el sistema dCas9-SunTag se puede utilizar para activar genes que están presentes de forma latente, como los genes de virus.
Aplicaciones
El sistema de activación dCas9 permite que se exprese un gen deseado o múltiples genes en la misma célula. Es posible estudiar genes implicados en un determinado proceso utilizando una pantalla amplia del genoma que implica la activación de la expresión de genes. Examinar qué sgRNAs producen un fenotipo sugiere qué genes están involucrados en una vía específica. El sistema de activación dCas9 se puede utilizar para controlar exactamente qué células se activan y en qué momento se produce la activación. Se han realizado construcciones de dCas9 que activan una proteína de fusión activadora de dCas9 en presencia de luz o sustancias químicas. Las células también pueden reprogramarse o diferenciarse de un tipo celular a otro aumentando la expresión de ciertos genes importantes para la formación o el mantenimiento de un tipo celular. [11]
Mayor control sobre la expresión genética
Un grupo de investigación utilizó un sistema en el que dCas9 se fusionó con un dominio particular, C1B1. Cuando se ilumina la celda con luz azul, el dominio Cry2 se une a C1B1. El dominio Cry2 se fusiona con un activador transcripcional , por lo que la luz azul apunta al activador al punto donde se une dCas9. El uso de la luz permite un gran control sobre cuándo se activa el gen objetivo. Al eliminar la luz de la célula, solo queda dCas9 en el gen objetivo, por lo que la expresión no aumenta. De esta forma, el sistema es reversible. [12] Se desarrolló un sistema similar usando control químico. En este sistema, dCas9 recluta una proteína de fusión MS2 que contiene el dominio FKBP. En presencia del RAP químico, un dominio FRB fusionado a un complejo modificador de cromatina se une a FKBP. Siempre que se agrega RAP a las células, se puede dirigir al gen un complejo modificador de cromatina específico . Eso permite a los científicos examinar cómo las modificaciones específicas de la cromatina afectan la expresión de un gen. [13] El sistema dCAs9-VPR se utiliza como activador dirigiéndolo al promotor de un gen corriente arriba de la región codificante. Un estudio utilizó varios sgRNA para apuntar a diferentes porciones del gen, y encontró que el activador dCas9-VPR puede actuar como activador o represor, dependiendo de la ubicación a la que se une. En una célula, los sgRNA que se dirigen al promotor podrían permitir que dCas9-VPR aumente la expresión, mientras que los sgRNA que se dirigen a la región codificante del gen dan como resultado una disminución de la expresión de dCas9-VPR. [14]
Activación de todo el genoma
La versatilidad de los sgRNA permite que los activadores de dCas9 aumenten la expresión de cualquier gen dentro del genoma de un organismo. Eso podría usarse para aumentar la expresión de un gen que codifica una proteína o un ARN transcrito. Un artículo demostró que la activación de todo el genoma podría usarse para determinar qué proteínas están involucradas en la resistencia mediada a un fármaco específico. [6] Otro artículo utilizó la activación de todo el genoma de ARN largos no codificantes y observó que el aumento de la expresión de ciertos ARN largos no codificantes confería resistencia al fármaco vemurafenib. [15] En ambos casos, las células que sobreviven al fármaco podrían estudiarse para determinar qué sgRNA contienen. Eso permite a los investigadores determinar qué gen se activó en cada célula superviviente, lo que sugiere qué genes son importantes para la resistencia a ese fármaco.
Uso en organismos
Una fusión de dCas9 con VP64, p65 y HSF1 (factor de choque térmico 1) permitió a los investigadores apuntar a genes en Arabidopsis thaliana y aumentar la transcripción a un nivel similar al de cuando el gen mismo se inserta en el genoma de la planta. Para uno de los dos genes probados, el activador dCas9 cambia el número y el tamaño de las hojas e hizo que las plantas pudieran soportar mejor la sequía. Los autores concluyen que el activador dCas9 puede crear fenotipos en plantas similares a los observados cuando se inserta un transgén para sobreexpresión. [16] Los investigadores han utilizado múltiples ARN guía para dirigir el sistema de activación dCas9 a múltiples genes en una cepa de ratón específica en la que dCas9 puede activarse en líneas celulares específicas utilizando el sistema Cre recombinasa . Los científicos utilizaron la focalización y el aumento de la expresión de varios genes para examinar los procesos involucrados en la regeneración y los carcinomas del hígado . [17]
Referencias
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