Electroforesis en gel con gradiente de temperatura
La electroforesis en gel con gradiente de temperatura ( TGGE ) y la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante ( DGGE ) son formas de electroforesis que utilizan un gradiente de temperatura o químico para desnaturalizar la muestra a medida que se mueve a través de un gel de acrilamida . TGGE y DGGE se pueden aplicar a ácidos nucleicos como el ADN y el ARN y (con menos frecuencia) a las proteínas. TGGE se basa en cambios de estructura dependientes de la temperatura para separar los ácidos nucleicos . DGGE separa genes del mismo tamaño en función de su diferente capacidad de desnaturalización, que está determinada por su secuencia de pares de bases. DGGE fue la técnica original y TGGE un refinamiento de la misma.
El mismo equipo se puede utilizar para el análisis de proteínas , que fue realizado por primera vez por Thomas E. Creighton del Laboratorio de Biología Molecular MRC , Cambridge, Inglaterra. [4] Las proteínas y los ácidos nucleicos producen patrones de aspecto similar, pero los principios fundamentales son bastante diferentes.
TGGE fue descrito por primera vez por Thatcher y Hodson [5] y por Roger Wartell de Georgia Tech. El grupo de Riesner en Alemania realizó un extenso trabajo. El equipo comercial para DGGE está disponible en Bio-Rad, INGENY y CBS Scientific; un sistema para TGGE está disponible en Biometra.
El ADN tiene una carga negativa y, por lo tanto, se moverá hacia el electrodo positivo en un campo eléctrico. Un gel es una malla molecular, con agujeros aproximadamente del mismo tamaño que el diámetro de la cadena de ADN. Cuando se aplica un campo eléctrico, el ADN comenzará a moverse a través del gel, a una velocidad aproximadamente inversamente proporcional a la longitud de la molécula de ADN (las longitudes más cortas de ADN viajan más rápido); esta es la base para la separación dependiente del tamaño en la electroforesis estándar. .
En TGGE también hay un gradiente de temperatura a través del gel. A temperatura ambiente, el ADN existirá de forma estable en forma de doble cadena. A medida que aumenta la temperatura, las hebras comienzan a separarse ( derretirse ) y la velocidad a la que se mueven a través del gel disminuye drásticamente. Fundamentalmente, la temperatura a la que se produce la fusión depende de la secuencia (los pares de bases de GC son más estables que los de AT debido a las interacciones de apilamiento, no a la diferencia en los enlaces de hidrógeno [ cita requerida ] (hay tres enlaces de hidrógeno entre un par de bases de citosina y guanina , pero solo dos entre adenina y timina )), por lo que TGGE proporciona un"método independiente del tamaño y dependiente de la secuencia" para separar moléculas de ADN. TGGE separa moléculas y brinda información adicional sobre el comportamiento de fusión y la estabilidad (Biometra, 2000).
La electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) funciona aplicando una pequeña muestra de ADN (o ARN) a un gel de electroforesis que contiene un agente desnaturalizante . Los investigadores han descubierto que ciertos geles desnaturalizantes son capaces de inducir la fusión del ADN en varias etapas. Como resultado de esta fusión, el ADN se propaga a través del gel y se puede analizar en busca de componentes individuales, incluso aquellos tan pequeños como 200-700 pares de bases .
