La mezcla de ADN es una forma de propagar rápidamente mutaciones beneficiosas en un experimento de evolución dirigida . [1] Se utiliza para aumentar rápidamente el tamaño de la biblioteca de ADN . [2]
Procedimiento
Primero, la ADNasa se usa para fragmentar un conjunto de genes parentales en trozos de 50-100 pb de longitud. Luego, esto es seguido por una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) sin cebadores: los fragmentos de ADN con suficiente secuencia homóloga superpuesta se aparearán entre sí y luego se extenderán por la ADN polimerasa .
Se permite que ocurran varias rondas de esta extensión de PCR, después de que algunas de las moléculas de ADN alcancen el tamaño de los genes parentales. Estos genes pueden luego amplificarse con otra PCR, esta vez con la adición de cebadores que están diseñados para complementar los extremos de las hebras. Los cebadores pueden tener secuencias adicionales añadidas a sus extremos 5 ', tales como secuencias para sitios de reconocimiento de enzimas de restricción necesarias para la ligación en un vector de clonación.
Es posible recombinar porciones de estos genes para generar híbridos o formas quiméricas con propiedades únicas, de ahí el término mezcla de ADN. [3]
Métodos de barajado
Usando enzimas de restricción
- Las enzimas de restricción que cortan en lugares similares se utilizan para digerir miembros de la familia de genes.
- Los fragmentos de ADN se unen con ADN ligasa.
- Se producen una gran cantidad de híbridos que pueden probarse para detectar propiedades únicas.
Usando DNAse 1
- Los diferentes miembros de la familia de genes se fragmentan utilizando DNasa 1 seguida de PCR.
- Durante la PCR, diferentes miembros de la familia se ceban de forma cruzada, es decir, los fragmentos de ADN homológicos se aparearán entre sí.
- Los híbridos generados se utilizan luego para generar una biblioteca de mutantes, que se prueban en busca de propiedades únicas.
Ver también
Referencias
- ^ Zhao, Huimin; Arnold, Frances H. (1997). "Optimización de la mezcla de ADN para la recombinación de alta fidelidad" (PDF) . Investigación de ácidos nucleicos . 25 (6): 1307–1308. doi : 10.1093 / nar / 25.6.1307 . PMC 146579 . PMID 9092645 .[ enlace muerto permanente ]
- ^ Cohen, J. (13 de julio de 2001). "Cómo funciona la mezcla de ADN". Ciencia . 293 (5528): 237. doi : 10.1126 / science.293.5528.237 . PMID 11452110 .
- ^ Bacher, Jamie M .; et al. (2002). "Evolución anticipatoria y barajado de ADN" . Biología del genoma . 3 (8): comentarios1021.1. doi : 10.1186 / gb-2002-3-8-reviews1021 . PMC 139397 . PMID 12186650 .