Pirocarbonato de dietilo
El pirocarbonato de dietilo ( DEPC ), también llamado dicarbonato de dietilo ( nombre IUPAC ), se usa en el laboratorio para inactivar las enzimas RNasa en agua y en utensilios de laboratorio. Lo hace mediante la modificación covalente de residuos de histidina (más fuertemente), lisina , cisteína y tirosina . [1] [2]
El agua tratada con DEPC (y por lo tanto libre de ARNasa) se utiliza en la manipulación de ARN en el laboratorio para reducir el riesgo de que el ARN sea degradado por las ARNasas.
El agua generalmente se trata con DEPC al 0,1% v / v durante al menos 2 horas a 37 ° C y luego se esteriliza en autoclave (al menos 15 min) para inactivar las trazas de DEPC. La inactivación de DEPC de esta manera produce CO 2 y etanol . Las concentraciones más altas de DEPC son capaces de desactivar cantidades más grandes de RNasa, pero las trazas o subproductos restantes pueden inhibir reacciones bioquímicas adicionales como la transcripción in vitro. Además, la modificación química del ARN, como la carboximetilación, es posible cuando están presentes trazas de DEPC o sus subproductos, lo que da como resultado una recuperación deficiente del ARN intacto incluso después del intercambio de tampón (después de la precipitación).
El DEPC es inestable en agua y susceptible de hidrólisis a dióxido de carbono y etanol, especialmente en presencia de un nucleófilo . Por esta razón, DEPC no se puede utilizar con tampones Tris o HEPES . Por el contrario, se puede utilizar con solución salina tamponada con fosfato o MOPS . [3] Una regla útil es que las enzimas o sustancias químicas que tienen activos -O :, -N: o -S: no pueden tratarse con DEPC para quedar libres de RNasa, ya que DEPC reacciona con estas especies. Además, los productos de degradación de DEPC pueden inhibir la transcripción in vitro.
La derivatización DEPC de histidinas también se usa para estudiar la importancia de los residuos de histidilo en las enzimas. La modificación de histidina por DEPC da como resultado derivados carbetoxilados en el nitrógeno N-omega-2 del anillo de imidazol . La modificación de histidinas con DEPC puede revertirse mediante tratamiento con hidroxilamina 0,5 M a pH neutro.
