PANTALLA ELECTRÓNICA
E-SCREEN es un ensayo de proliferación celular basado en la proliferación mejorada de células de cáncer de mama humano ( MCF-7 ) en presencia de sustancias activas de estrógeno . La prueba E-SCREEN es una herramienta para evaluar fácil y rápidamente la actividad estrogénica de los xenoestrógenos sospechosos (solos o en combinación). Este bioensayo mide el aumento del número de células de cáncer de mama humano inducido por estrógenos, que es biológicamente equivalente al aumento de la actividad mitótica en los tejidos del tracto genital. Fue desarrollado originalmente por Soto et al [1] y fue incluido en la primera versión de la OCDEMarco conceptual para pruebas y evaluación de disruptores endocrinos publicado en 2012. Sin embargo, debido a una validación fallida, no se incluyó en la versión actualizada del marco publicada en 2018. [2]
El ensayo de proliferación celular E-SCREEN se realiza con la línea celular de cáncer de mama MCF-7 humano , una línea celular estrogénica establecida que expresa endógenamente ERα . [1] [3] [4]
Los MCF-7 humanos se cultivan en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal (FBS) y rojo fenol como marcador tampón (medio de cultivo), a 37 °C, en una atmósfera de 5 % de CO₂ y 95 % de aire en condiciones de saturación. humedad. Para realizar el ensayo E-SCREEN, las células se tripsinizan y se colocan en placas de cultivo de pocillos . Se permite que las células se adhieran durante 24 h, y luego se retira el medio de siembra y se reemplaza con el medio de cultivo experimental (DMEM sin rojo fenol con suero bovino fetal tratado con carbón dextrano -sin esteroides-).
Para ensayar sustancias sospechosas de estrógeno activo, se añade al medio experimental un rango de concentraciones del compuesto de prueba. En cada experimento, las células se exponen a una serie de diluciones de 17β-estradiol (0,1 pM–1000 pM) para proporcionar un control positivo (curva dosis-respuesta estándar) y se tratan solo con medio libre de hormonas como control negativo. El bioensayo finaliza el día 6 (fase exponencial tardía) retirando los medios de los pocillos y fijando las células con ácido tricloroacético . Después de la incubación (30 min; 4 °C) se elimina el ácido tricloroacético lavando las placas con un chorro suave de agua fría. Después de secar las placas a 40 °C, la proteína celular se tiñe con sulforhodamina B (SRB). Después de la incubación (10 min), el colorante se lava con ácido acético acuoso (1%) y las placas se secan nuevamente a 40 °C. Finalmente, el colorante unido se solubiliza con tampón tris y se incuba (20 min; 4 °C) y se lee la absorbancia a 492 nm.
Los resultados de actividad estrogénica se expresan como media ± desviación estándar del efecto proliferativo (PE), que representa la proliferación máxima inducida por el compuesto de prueba, y es la relación entre el número de células más alto logrado con la muestra o 17-β-estradiol y el número de celular en el grupo de control :
