La mancha inmunoabsorbente ligada a enzimas ( ELISpot ) es un tipo de ensayo que se enfoca en medir cuantitativamente la frecuencia de secreción de citocinas para una sola célula. El ensayo ELISpot también es una forma de inmunotinción, ya que se clasifica como una técnica que utiliza anticuerpos para detectar un analito de proteína, y la palabra analito se refiere a cualquier sustancia biológica o química que se identifica o mide.
El ensayo FluoroSpot es una variación del ensayo ELISpot. El ensayo FluoroSpot utiliza fluorescencia para analizar múltiples analitos, lo que significa que puede detectar la secreción de más de un tipo de proteína.
Historia
Cecil Czerkinsky describió por primera vez ELISpot en 1983 como una nueva forma de cuantificar la producción de una inmunoglobulina específica de antígeno por las células de hibridoma . En 1988, Czerkinsky desarrolló un ensayo ELISA punto que cuantifica la secreción de una linfoquina por células T . En el mismo año, ELISpot de dos colores se combinó por primera vez con imágenes por computadora, lo que permitió la enumeración y el análisis de manchas. 1988 también marcó el primer uso de placas con fondo de membrana para realizar estos ensayos. [1]
Mecanismo de ELISpot
- Recubrimiento de anticuerpos : a lo largo de la técnica de ensayo ELISpot, se agregan diferentes sustancias y se lavan de los pocillos. Los pocillos se encuentran en una placa de laboratorio con pequeños platos / tazones que pueden llenarse con una sustancia para ser examinada; la cantidad de pocillos en una placa varía, pero generalmente varía entre 16 y 100. La primera sustancia que se agrega a los pocillos son los anticuerpos monoclonales específicos de citocinas. Estos anticuerpos recubren las paredes de los pocillos para unirse en el futuro a las citocinas. Los anticuerpos monoclonales significan que el anticuerpo se produce a partir de un único linaje celular y solo puede unirse a un epítopo de proteína. Los anticuerpos policlonales , por otro lado, son capaces de unirse a múltiples epítopos de la misma proteína.
- Incubación celular : Las células deseadas que se están observando y analizando se agregan a los pocillos. Cada pocillo puede tener la presencia o ausencia de estímulos que activen la secreción de citocinas en las células. Durante la incubación celular, se permite que las células reaccionen a cualquier estímulo presente y secreten citocinas. Hay muchos procedimientos y métodos a seguir para garantizar un manejo adecuado de las células. Para asegurarse de que las células sean de alta calidad, las células de las muestras de sangre deben agitarse ligeramente si se almacenan durante más de 3 horas, las muestras de sangre deben diluirse en PBS ( solución salina tamponada con fosfato ) antes de almacenarse y las muestras de sangre no deben tener granulocitos . Cualquier célula que haya sido criopreservada y descongelada debe dejarse reposar durante una hora o más a 37 grados Celsius (la temperatura típica del cuerpo humano). [2] También hay muchas cosas que deben tenerse en cuenta al incubar las células, como asegurarse de que las células no experimenten movimientos repentinos que puedan afectar la formación de manchas, o que la humedad de la incubadora sea lo suficientemente alta como para evitar una evaporación excesiva y secando los pozos. [3]
- Captura de citocinas : dado que las células están rodeadas por anticuerpos monoclonales específicos de citocinas que recubren las paredes de los pocillos, las citocinas que han sido secretadas por las células incubadas comenzarán a unirse a los anticuerpos en un epítopo específico.
- Anticuerpos de detección : en este punto, los pocillos deben enjuagarse para eliminar las células y cualquier otra sustancia indeseable. Todo lo que debe quedar son los anticuerpos monoclonales específicos de citocina y cualquier citocina que se uniera a los anticuerpos. A continuación, se añaden al pocillo anticuerpos de detección específicos de citocina biotinilados . Estos anticuerpos de detección específicos de citocina se unirán a cualquier citocina que quede en el pocillo, ya que la citocina todavía está unida al primer conjunto de anticuerpos utilizados. Dado que la citoquina se unió al primer conjunto de anticuerpos que recubren los pocillos, la citoquina no se eliminó cuando se enjuagaron los pocillos.
- Conjugado de estreptavidina-enzima : se añade un conjugado de estreptavidina-enzima a los pocillos para unirse con los anticuerpos de detección. El propósito de biotinilar los anticuerpos de detección específicos de citocina añadidos a los pocillos en el paso anterior es para que el anticuerpo pueda unirse al nuevo conjugado de estreptavidina-enzima. La biotinilación básicamente crea una fuerte afinidad entre la biotina del anticuerpo específico de citocina y la estreptavidina del conjugado. [4]
- Adición de sustrato : Se agrega un sustrato a los pocillos y es catalizado por el conjugado de enzima agregado en el paso anterior. Esta reacción forma un precipitado insoluble que forma manchas en los pozos. El sustrato que utilice en este paso dependerá del tipo de enzima utilizada en el paso anterior. Si se usa estreptavidina-ALP (conjugado de estreptavidina y fosfatasa alcalina), entonces se producirá el uso de BCIP / NBT-plus (una mezcla de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo y cloruro de tetrazolio azul nitro) [5] como sustrato puntos más distintos que son más fáciles de analizar. Si se usa estreptavidina-HRP (conjugado de estreptavidina y peroxidasa de rábano picante), entonces el uso de TMB (tetrametilbencidina) [6] como sustrato producirá mejores resultados. [7]
- Análisis : las manchas que se forman se pueden leer en un lector ELISpot automático o contar con un microscopio de disección y luego se pueden usar para calcular la frecuencia de secreción de citocinas.
Mecanismo de FluoroSpot
El ensayo FluoroSpot es muy similar al ensayo ELISpot. La principal diferencia es que el ensayo FluoroSpot puede analizar la presencia de múltiples analitos en una placa de pocillos, mientras que el ensayo ELISpot solo puede analizar un analito a la vez. El ensayo FluoroSpot logra esto mediante el uso de fluorescencia en lugar de una reacción enzimática para la detección. Los pasos para un ensayo FluoroSpot también son similares, con algunas diferencias. [8]
- Recubrimiento de anticuerpos : similar al ELISpot, los anticuerpos de captura monoclonales específicos de citocina se agregan a una placa con pocillos. Para ambos ensayos, las placas se tratan con etanol para evitar la contaminación y la recopilación de datos sesgada. Para el ensayo FluoroSpot, se adjunta una mezcla de diferentes tipos de anticuerpos de captura a los pocillos para detectar múltiples tipos de analitos. Para obtener resultados óptimos con ELISpot y el ensayo FluoroSpot, se deben seguir las técnicas de recubrimiento de placas adecuadas. Las placas deben tratarse con etanol, lavarse y luego recubrirse con anticuerpos. Los métodos de tratamiento con etanol también varían según el tipo de placas que se utilicen. Para las placas MSIP e IPFL, debe agregar 15 microlitros de etanol al 35% a todos los pocillos. Deje que el etanol se asiente en los pocillos durante un minuto y luego viértalo. Para las placas MAIPSWU, debe agregar 50 microlitros de etanol al 70% a todos los pocillos. Deje que el etanol se asiente en los pocillos durante dos minutos y luego viértalo. Después de haber tratado los pocillos con etanol, debe lavar todos los pocillos con 200 microlitros de agua esterilizada. Este proceso de lavado debe repetirse un total de 5 veces. Una vez que los pocillos se han tratado con etanol y se han lavado, se pueden añadir a cada pocillo los anticuerpos de captura monoclonales específicos de citocina. [9]
- Incubación celular : las células se agregan a los pocillos y se incuban en presencia o ausencia de estímulos que afecten la secreción de proteínas.
- Captura de citocinas : las proteínas / analitos que son secretados por las células incubadas se unirán a los anticuerpos de captura unidos a los pocillos durante el primer paso.
- Anticuerpos de detección : similar al ELISpot, una vez que se enjuagan los pocillos para eliminar las células y otras sustancias que no estamos interesados en identificar o medir, se agrega un anticuerpo de detección biotinilado (esto es específico para un tipo de analito que desee para cuantificar) y luego se agregan anticuerpos de detección marcados con etiquetas para el segundo y tercer tipo de analitos que se están estudiando.
- Conjugados marcados con fluoróforo : en lugar de agregar un conjugado de estreptavidina-enzima, la detección de múltiples analitos se amplifica en el FluoroSpot con el uso de un anticuerpo anti-etiqueta marcado con fluoróforo y un conjugado de estreptavidina-fluoróforo. A fluorescencia también se añade solución de potenciador durante este paso con el fin de mejorar las señales utilizadas más adelante en el análisis de los colores de fluorescencia en los pocillos. Esta fluorescencia es lo que hace posible que el FluoroSpot analice y compare múltiples analitos, a diferencia del ELISpot.
- Análisis : dado que FluoroSpot se basa en el uso de fluorescencia y no en una reacción enzimática, no es necesario un paso que agregue un sustrato para reaccionar con las enzimas (según sea necesario para ELISpot). El último paso para el ensayo FluoroSpot es analizar los fluoróforos con un lector de fluorescencia automático que tiene filtros separados para los diferentes fluoróforos que se analizan. Estos filtros deben seleccionarse para las longitudes de onda específicasde los fluoróforos si desea mediciones precisas. [8]
Dado que el ensayo FluoroSpot identifica y cuantifica la presencia de múltiples analitos, es posible que la absorción de un analito pueda afectar la secreción de otro analito; esto se llama efectos de captura. [8] El efecto que tiene un analito sobre otro analito podría ser positivo o negativo (la producción del segundo analito puede aumentar o disminuir). Para contrarrestar los efectos de captura, es posible utilizar la coestimulación para evitar la disminución de la producción de un analito. [8] Esto es cuando se agrega a los pocillos un segundo anticuerpo que estimula la producción del mismo analito.
Aplicaciones de ELISpot y FluoroSpot
Los ensayos ELISpot y FluoroSpot se pueden utilizar en muchos campos de investigación: desarrollo de vacunas, [10] cáncer, [11] alergias, [12] caracterización de monocitos / macrófagos / células dendríticas, análisis de apolipoproteínas e investigación veterinaria. Con ELISpot, puede estudiar respuestas de citocinas específicas de antígeno, células secretoras específicas de anticuerpos, [13] antígenos tumorales, [11] liberación de granzima B y Perforina por células T, eficacia de la vacuna, [14] mapeo de epítopos, [15] T citotóxico -actividad celular, detección de IL-4, IL-5 e IL-13, [12] respuestas de anticuerpos inducidas por vacunas, células B de memoria específicas de antígeno, [10] y mucho más.
Más específicamente, el ensayo ELISpot de células T se usa para caracterizar subconjuntos de células T. Esto se debe a que el ensayo puede detectar la producción de citocinas IFN-y, IL-2, TNF-alfa, IL-4, IL-5 e IL-13. Las primeras tres citocinas son producidas por células Th1, mientras que las últimas tres son producidas por células Th2. La medición de las respuestas de las células T a través de la producción de citocinas también permite estudiar la eficacia de la vacuna. [dieciséis]
Con FluoroSpot de células T, puede controlar los linfocitos que se infiltran en el tumor. También puede analizar la secreción de citocinas IFN-y y granzima B para evaluar las respuestas de las células T citotóxicas. Ambos se utilizan para la investigación del cáncer. [17]
Con FluoroSpot de células B, la eficacia de la vacuna también se puede observar cuantificando la secreción de IgG, IgA e IgM antes y después de una vacuna. Este análisis de múltiples inmunoglobulinas es posible gracias al método de fluorescencia utilizado en el FluoroSpot. [17]
Referencias
- ^ Ranieri, Elena; Popescu, Iulia; Gigante, Margherita (2014). "Ensayo CTL ELISPOT". Células T citotóxicas . Métodos en Biología Molecular. 1186 . págs. 75–86. doi : 10.1007 / 978-1-4939-1158-5_6 . ISBN 978-1-4939-1157-8. PMID 25149304 .
- ^ "Celdas para ELISpot y FluoroSpot" . MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
- ^ "Incubación celular" . MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
- ^ "Biotinilación" . ThermoFisher Scientific . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
- ^ "Resumen de SDS de BCIP / NBT-plus" (PDF) . MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
- ^ "Ficha técnica / Protocolo de TMB" (PDF) . MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
- ^ "Sustratos ELISpot" . MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
- ^ a b c d "Principio del ensayo FluoroSpot" . MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
- ^ "Guía de recubrimiento de placas" . MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
- ^ a b "Desarrollo de vacunas" . MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
- ^ a b "Cáncer" . MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
- ^ a b "Alergia" . MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
- ^ Czerkinsky, CC (16 de diciembre de 1983). "Un ensayo de inmunospot ligado a enzima (ELISPOT) en fase sólida para la enumeración de células secretoras de anticuerpos específicos". Revista de métodos inmunológicos . 65 (1-2): 109-121. doi : 10.1016 / 0022-1759 (83) 90308-3 . PMID 6361139 .
- ^ Saletti, Giulietta (9 de mayo de 2013). "Ensayos de inmunospot ligados a enzimas para la medición directa ex vivo de respuestas inmunes humorales humanas inducidas por vacuna en sangre". Protocolos de la naturaleza . 8 (6): 1073–1087. doi : 10.1038 / nprot.2013.058 . PMID 23660756 . S2CID 38317207 .
- ^ "Ensayos ELISpot de células T" . PROIMMUNE . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
- ^ Strand, Nacka. "Encuentra 1 celda en 100.000 con ELISpot" (PDF) . MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .
- ^ a b Strand, Nacka. "Descubra más con FluoroSpot" (PDF) . MABTECH . Consultado el 6 de diciembre de 2018 .