La cinética de enzimas

Estudio de las velocidades de reacción bioquímica catalizadas por una enzima.

Dihidrofolato reductasa de E. coli con sus dos sustratos dihidrofolato (derecha) y NADPH (izquierda), unidos en el sitio activo. La proteína se muestra como un diagrama de cinta , con hélices alfa en rojo, vainas beta en amarillo y bucles en azul. Generado a partir de 7DFR .

La cinética enzimática es el estudio de la velocidad de las reacciones químicas catalizadas por enzimas . En cinética enzimática, se mide la velocidad de reacción y se investigan los efectos de variar las condiciones de la reacción. El estudio de la cinética de una enzima de esta manera puede revelar el mecanismo catalítico de esta enzima, su papel en el metabolismo , cómo se controla su actividad y cómo un fármaco o un modificador ( inhibidor o activador ) podría afectar la velocidad.

Una enzima (E) es típicamente una molécula de proteína que promueve la reacción de otra molécula, su sustrato (S). Este se une al sitio activo de la enzima para producir un complejo enzima-sustrato ES, y se transforma en un complejo enzima-producto EP y de allí al producto P, a través de un estado de transición ES *. La serie de pasos se conoce como mecanismo :

E + S ⇄ ES ⇄ ES * ⇄ EP ⇄ E + P

Este ejemplo asume el caso más simple de una reacción con un sustrato y un producto. Tales casos existen: por ejemplo, una mutasa como la fosfoglucomutasa cataliza la transferencia de un grupo fosfo de una posición a otra, e isomerasa es un término más general para una enzima que cataliza cualquier reacción de un sustrato y un producto, como la triosafosfato isomerasa . Sin embargo, tales enzimas no son muy comunes y son superadas en gran medida por las enzimas que catalizan reacciones de dos sustratos y dos productos: estas incluyen, por ejemplo, las deshidrogenasas dependientes de NAD como la alcohol deshidrogenasa , que cataliza la oxidación del etanol por NAD ⁺. Las reacciones con tres o cuatro sustratos o productos son menos comunes, pero existen. No es necesario que el número de productos sea igual al número de sustratos; por ejemplo, la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa tiene tres sustratos y dos productos.

Cuando las enzimas se unen a múltiples sustratos, como la dihidrofolato reductasa (que se muestra a la derecha), la cinética enzimática también puede mostrar la secuencia en la que se unen estos sustratos y la secuencia en la que se liberan los productos. Un ejemplo de enzimas que se unen a un solo sustrato y liberan múltiples productos son las proteasas , que escinden un sustrato proteico en dos productos polipeptídicos. Otros unen dos sustratos, como la ADN polimerasa que une un nucleótido al ADN . Aunque estos mecanismos suelen ser una serie compleja de pasos, normalmente hay un paso que determina la velocidad que determina la cinética general. Este paso determinante de la tasapuede ser una reacción química o un cambio conformacional de la enzima o sustratos, como los involucrados en la liberación de producto (s) de la enzima.

El conocimiento de la estructura de la enzima es útil para interpretar los datos cinéticos. Por ejemplo, la estructura puede sugerir cómo se unen los sustratos y productos durante la catálisis; qué cambios ocurren durante la reacción; e incluso el papel de determinados residuos de aminoácidos en el mecanismo. Algunas enzimas cambian de forma significativamente durante el mecanismo; en tales casos, es útil determinar la estructura de la enzima con y sin análogos de sustrato unidos que no experimentan la reacción enzimática.

No todos los catalizadores biológicos son enzimas proteicas: los catalizadores basados ​​en ARN , como las ribozimas y los ribosomas, son esenciales para muchas funciones celulares, como el empalme y la traducción del ARN . La principal diferencia entre las ribozimas y las enzimas es que los catalizadores de ARN están compuestos de nucleótidos, mientras que las enzimas están compuestas de aminoácidos ... Las ribozimas también realizan un conjunto más limitado de reacciones, aunque sus mecanismos de reacción y cinética se pueden analizar y clasificar por los mismos métodos.

Principios generales

A medida que se agregan cantidades mayores de sustrato a una reacción, los sitios de unión de enzimas disponibles se llenan hasta el límite de . Más allá de este límite, la enzima se satura con sustrato y la velocidad de reacción deja de aumentar. V max {\ Displaystyle V _ {\ max}}

La reacción catalizada por una enzima utiliza exactamente los mismos reactivos y produce exactamente los mismos productos que la reacción no catalizada. Como otros catalizadores , las enzimas no alteran la posición de equilibrio entre sustratos y productos. ^[1] Sin embargo, a diferencia de las reacciones químicas no catalizadas, las reacciones catalizadas por enzimas muestran una cinética de saturación. ^[2] Para una concentración de enzima dada y para concentraciones de sustrato relativamente bajas, la velocidad de reacción aumenta linealmente con la concentración de sustrato; las moléculas de enzima son en gran parte libres para catalizar la reacción, y el aumento de la concentración de sustrato significa una velocidad creciente a la que las moléculas de enzima y sustrato se encuentran entre sí. Sin embargo, a concentraciones de sustrato relativamente altas, la velocidad de reacción se aproxima asintóticamente al máximo teórico; casi todos los sitios activos de la enzima están ocupados por sustratos que dan como resultado la saturación, y la velocidad de reacción está determinada por la velocidad de renovación intrínseca de la enzima. ^[3] El medio camino concentración de sustrato entre estos dos casos límite se denota por K _M . Por lo tanto, K_M es la concentración de sustrato a la que la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. ^[3]

Las dos propiedades cinéticas más importantes de una enzima son la facilidad con la que la enzima se satura con un sustrato particular y la velocidad máxima que puede alcanzar. Conocer estas propiedades sugiere lo que podría hacer una enzima en la célula y puede mostrar cómo responderá la enzima a los cambios en estas condiciones.

Ensayos de enzimas

Artículo principal: ensayo enzimático

Curva de progreso para una reacción enzimática. La pendiente en el período de velocidad inicial es la velocidad inicial de reacción v . La ecuación de Michaelis-Menten describe cómo varía esta pendiente con la concentración de sustrato.

Los ensayos enzimáticos son procedimientos de laboratorio que miden la velocidad de las reacciones enzimáticas. Dado que las reacciones que catalizan no consumen enzimas, los ensayos enzimáticos suelen seguir cambios en la concentración de sustratos o productos para medir la velocidad de reacción. Existen muchos métodos de medición. Los ensayos espectrofotométricos observan cambios en la absorbancia de luz entre productos y reactivos; Los ensayos radiométricos implican la incorporación o liberación de radiactividad.para medir la cantidad de producto elaborado a lo largo del tiempo. Los ensayos espectrofotométricos son los más convenientes ya que permiten medir continuamente la velocidad de la reacción. Aunque los ensayos radiométricos requieren la extracción y el recuento de muestras (es decir, son ensayos discontinuos), suelen ser extremadamente sensibles y pueden medir niveles muy bajos de actividad enzimática. ^[4] Un enfoque análogo consiste en utilizar la espectrometría de masas para controlar la incorporación o liberación de isótopos estables a medida que el sustrato se convierte en producto. Ocasionalmente, un ensayo falla y los enfoques son esenciales para resucitar un ensayo fallido.

Los ensayos enzimáticos más sensibles utilizan láseres enfocados a través de un microscopio para observar cambios en moléculas enzimáticas individuales a medida que catalizan sus reacciones. Estas mediciones utilizan cambios en la fluorescencia de los cofactores durante el mecanismo de reacción de una enzima o colorantes fluorescentes añadidos en sitios específicos de la proteína para informar los movimientos que ocurren durante la catálisis. ^[5] Estos estudios proporcionan una nueva visión de la cinética y la dinámica de enzimas individuales, a diferencia de la cinética enzimática tradicional, que observa el comportamiento promedio de poblaciones de millones de moléculas enzimáticas. ^{[6] [7]}

Arriba se muestra un ejemplo de curva de progreso para un ensayo enzimático. La enzima produce producto a una velocidad inicial que es aproximadamente lineal durante un período corto después del inicio de la reacción. A medida que avanza la reacción y se consume el sustrato, la velocidad disminuye continuamente (siempre que el sustrato no esté todavía en niveles de saturación). Para medir la velocidad inicial (y máxima), los ensayos enzimáticos se llevan a cabo típicamente mientras la reacción ha progresado solo un pequeño porcentaje hacia la finalización total. La duración del período de velocidad inicial depende de las condiciones del ensayo y puede oscilar entre milisegundos y horas. Sin embargo, el equipo para mezclar líquidos rápidamente permite mediciones cinéticas rápidas en velocidades iniciales de menos de un segundo. ^[8] Estos ensayos muy rápidos son esenciales para medir la cinética previa al estado estacionario, que se comentan a continuación.

La mayoría de los estudios de cinética enzimática se concentran en esta parte inicial, aproximadamente lineal, de las reacciones enzimáticas. Sin embargo, también es posible medir la curva de reacción completa y ajustar estos datos a una ecuación de velocidad no lineal . Esta forma de medir las reacciones enzimáticas se denomina análisis de curva de progreso. ^[9] Este enfoque es útil como alternativa a la cinética rápida cuando la velocidad inicial es demasiado rápida para medir con precisión.

Reacciones de un solo sustrato

Las enzimas con mecanismos de sustrato único incluyen isomerasas como la triosafosfatoisomerasa o bifosfoglicerato mutasa , liasas intramoleculares como la adenilato ciclasa y la ribozima de cabeza de martillo , una ARN liasa. ^[10] Sin embargo, algunas enzimas que solo tienen un sustrato único no entran en esta categoría de mecanismos. La catalasa es un ejemplo de esto, ya que la enzima reacciona con una primera molécula de peróxido de hidrógeno.sustrato, se oxida y luego se reduce por una segunda molécula de sustrato. Aunque está involucrado un solo sustrato, la existencia de un intermedio enzimático modificado significa que el mecanismo de la catalasa es en realidad un mecanismo de ping-pong, un tipo de mecanismo que se analiza en la sección Reacciones de múltiples sustratos a continuación.

Cinética de Michaelis-Menten

Curva de saturación para una reacción enzimática que muestra la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad de reacción.

Artículo principal: cinética de Michaelis-Menten

Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, su velocidad de catálisis no muestra una respuesta lineal al aumento de sustrato. Si la velocidad inicial de la reacción se mide en un rango de concentraciones de sustrato (denotado como [S]), la velocidad de reacción inicial ( ) aumenta a medida que aumenta [S], como se muestra a la derecha. Sin embargo, a medida que aumenta [S], la enzima se satura con sustrato y la tasa inicial alcanza V _max , la tasa máxima de la enzima.${\displaystyle v_{0}}$

El modelo cinético de Michaelis-Menten de una reacción de un solo sustrato se muestra a la derecha. Hay una reacción bimolecular inicial entre la enzima E y el sustrato S para formar el complejo enzima-sustrato ES. La velocidad de la reacción enzimática aumenta con el aumento de la concentración de sustrato hasta un cierto nivel llamado V _max ; a V _max , el aumento en la concentración de sustrato no causa ningún aumento en la velocidad de reacción ya que no hay más enzima (E) disponible para reaccionar con el sustrato (S). Aquí, la velocidad de reacción se vuelve dependiente del complejo ES y la reacción se convierte en una reacción unimolecular con un orden de cero. Aunque el mecanismo enzimático de la reacción unimolecular ${\displaystyle {\ce {ES ->[k_{cat}] E + P}}}$puede ser bastante complejo, por lo general hay un paso enzimático determinante de la velocidad que permite modelar esta reacción como un solo paso catalítico con una constante de velocidad unimolecular aparente k _cat . Si la ruta de reacción avanza sobre uno o varios intermedios, k _cat será una función de varias constantes de velocidad elementales, mientras que en el caso más simple de una sola reacción elemental (por ejemplo, sin intermediarios) será idéntica a la constante de velocidad unimolecular elemental k ₂ . La constante de velocidad unimolecular aparente k _cat también se denomina número de rotación y denota el número máximo de reacciones enzimáticas catalizadas por segundo.

La ecuación de Michaelis-Menten ^[11] describe cómo la velocidad de reacción (inicial) v ₀ depende de la posición del equilibrio de unión al sustrato y de la constante de velocidad k ₂ .

${\displaystyle v_{0}={\frac {V_{\max }[{\ce {S}}]}{K_{M}+[{\ce {S}}]}}}$    (Ecuación de Michaelis-Menten)

con las constantes

${\displaystyle {\begin{aligned}K_{M}\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{2}+k_{-1}}{k_{1}}}\approx K_{D}\\V_{\max }\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ k_{cat}{\ce {[E]}}_{tot}\end{aligned}}}$

Esta ecuación de Michaelis-Menten es la base de la mayoría de las cinéticas enzimáticas de un solo sustrato. ^[12] Dos supuestos cruciales subyacen a esta ecuación (aparte del supuesto general sobre el mecanismo que sólo implica inhibición de producto o intermedio, y no hay alostericidad o cooperatividad ). El primer supuesto es el supuesto supuesto de estado cuasi-estacionario (o hipótesis del estado pseudo-estacionario), a saber, que la concentración de la enzima unida al sustrato (y por lo tanto también la enzima libre) cambia mucho más lentamente que las de la enzima. producto y sustrato y, por lo tanto, el cambio a lo largo del tiempo del complejo se puede establecer en cero . El segundo supuesto es que la concentración total de enzimas no cambia con el tiempo, por lo tanto${\displaystyle d{\ce {[ES]}}/{dt}\;{\overset {!}{=}}\;0}$${\displaystyle {\ce {[E]}}_{\text{tot}}={\ce {[E]}}+{\ce {[ES]}}\;{\overset {!}{=}}\;{\text{const}}}$. Puede encontrar una derivación completa aquí .

La constante de Michaelis K _M se define experimentalmente como la concentración a la que la velocidad de la reacción enzimática es la mitad de V _max , lo que se puede verificar sustituyendo [S] = K _M en la ecuación de Michaelis-Menten y también se puede ver gráficamente. Si el paso enzimático que determina la velocidad es lento en comparación con la disociación del sustrato ( ), la constante de Michaelis K _M es aproximadamente la constante de disociación K _D del complejo ES.${\displaystyle k_{2}\ll k_{-1}}$

Si es pequeño en comparación con el término y también se forma muy poco complejo ES, por lo tanto . Por lo tanto, la tasa de formación de producto es${\displaystyle {\ce {[S]}}}$${\displaystyle K_{M}}$${\displaystyle [{\ce {S}}]/(K_{M}+[{\ce {S}}])\approx [{\ce {S}}]/K_{M}}$${\displaystyle {\ce {[E]_{\rm {tot}}\approx [E]}}}$

${\displaystyle v_{0}\approx {\frac {k_{cat}}{K_{M}}}{\ce {[E][S]}}\qquad \qquad {\text{if }}[{\ce {S}}]\ll K_{M}}$

Por tanto, la velocidad de formación del producto depende de la concentración de enzima así como de la concentración de sustrato, la ecuación se asemeja a una reacción bimolecular con una constante de velocidad de pseudo segundo orden correspondiente . Esta constante es una medida de la eficiencia catalítica . Las enzimas más eficientes alcanzan un rango de 10 ⁸ - 10 ¹⁰ M ⁻¹ s ⁻¹ . Estas enzimas son tan eficientes que catalizan eficazmente una reacción cada vez que encuentran una molécula de sustrato y, por tanto, han alcanzado un límite teórico superior de eficacia ( límite de difusión ); ya veces se las denomina enzimas cinéticamente perfectas . ^[13]${\displaystyle k_{2}/K_{M}}$${\displaystyle k_{2}/K_{M}}$  Pero la mayoría de las enzimas están lejos de ser perfectas: los valores promedio de y son aproximadamente y , respectivamente. ^[14]${\displaystyle k_{2}/K_{\rm {M}}}$${\displaystyle k_{2}}$${\displaystyle 10^{5}{\rm {s}}^{-1}{\rm {M}}^{-1}}$${\displaystyle 10{\rm {s}}^{-1}}$

Uso directo de la ecuación de Michaelis-Menten para el análisis cinético del curso del tiempo

Más información: Ecuación de tarifas

Más información: Análisis cinético del progreso de la reacción

Las velocidades observadas predichas por la ecuación de Michaelis-Menten se pueden usar para modelar directamente la desaparición del sustrato en el tiempo y la producción de producto mediante la incorporación de la ecuación de Michaelis-Menten en la ecuación para la cinética química de primer orden. Sin embargo, esto solo se puede lograr si se reconoce el problema asociado con el uso del número de Euler en la descripción de la cinética química de primer orden. es decir, e ^{- k} es una constante de división que introduce un error sistemático en los cálculos y se puede reescribir como una única constante que representa el sustrato restante después de cada período de tiempo. ^[15]

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-k)^{t}\,}$

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-v/[S]_{0})^{t}\,}$

${\displaystyle [S]=[S]_{0}(1-(V_{\max }[S]_{0}/(K_{M}+[S]_{0})/[S]_{0}))^{t}\,}$

En 1983 Stuart Beal (y también de forma independiente Santiago Schnell y Claudio Mendoza en 1997) derivó una solución de forma cerrada para el análisis de la cinética del curso del tiempo del mecanismo de Michaelis-Menten. ^{[16] [17]} La solución, conocida como ecuación de Schnell-Mendoza, tiene la forma:

${\displaystyle {\frac {[S]}{K_{M}}}=W\left[F(t)\right]\,}$

donde W [] es la función de Lambert-W . ^{[18] [19]} y donde F (t) es

${\displaystyle F(t)={\frac {[S]_{0}}{K_{M}}}\exp \!\left({\frac {[S]_{0}}{K_{M}}}-{\frac {V_{\max }}{K_{M}}}\,t\right)\,}$

Esta ecuación está englobada por la siguiente ecuación, obtenida por Berberan-Santos, ^[20] que también es válida cuando la concentración inicial de sustrato es cercana a la de la enzima,

${\displaystyle {\frac {[S]}{K_{M}}}=W\left[F(t)\right]-{\frac {V_{\max }}{k_{cat}K_{M}}}\ {\frac {W\left[F(t)\right]}{1+W\left[F(t)\right]}}\,}$

donde W [] es nuevamente la función Lambert-W .

Gráficas lineales de la ecuación de Michaelis-Menten

Consulte también: diagrama de Lineweaver-Burk y diagrama de Eadie-Hofstee

Lineweaver-Burk o gráfico recíproco doble de datos cinéticos, que muestra la importancia de las intersecciones del eje y el gradiente.

La gráfica de v versus [S] anterior no es lineal; aunque inicialmente es lineal en [S] bajo, se dobla para saturar en [S] alto. Antes de la era moderna del ajuste de curvas no lineal en las computadoras, esta no linealidad podría dificultar la estimación precisa de K _M y V _máx . Por lo tanto, varios investigadores desarrollaron linealizaciones de la ecuación de Michaelis-Menten, como el diagrama de Lineweaver-Burk , el diagrama de Eadie-Hofstee y el diagrama de Hanes-Woolf.. Todas estas representaciones lineales pueden ser útiles para visualizar datos, pero ninguna debe usarse para determinar parámetros cinéticos, ya que hay software de computadora disponible que permite una determinación más precisa mediante métodos de regresión no lineal . ^[21]

El gráfico de Lineweaver-Burk o gráfico recíproco doble es una forma común de ilustrar datos cinéticos. Esto se produce tomando el recíproco de ambos lados de la ecuación de Michaelis-Menten. Como se muestra a la derecha, esta es una forma lineal de la ecuación de Michaelis-Menten y produce una línea recta con la ecuación y = m x + c con una intersección en y equivalente a 1 / V _máx y una intersección en x de la gráfica representando -1 / K _M .

${\displaystyle {\frac {1}{v}}={\frac {K_{M}}{V_{\max }[{\mbox{S}}]}}+{\frac {1}{V_{\max }}}}$

Naturalmente, no se pueden tomar valores experimentales con 1 / [S] negativo; el valor límite inferior 1 / [S] = 0 (la intersección y ) corresponde a una concentración de sustrato infinita, donde 1 / v = 1 / V _máx como se muestra a la derecha; por lo tanto, la intercepción x es una extrapolación de los datos experimentales tomados a concentraciones positivas. Más generalmente, la representación de Lineweaver-Burk sesga la importancia de las mediciones tomadas a bajas concentraciones de sustrato y, por tanto, puede producir estimaciones inexactas de V _max y K _M . ^[22] Un método de trazado lineal más preciso es el diagrama de Eadie-Hofstee . En este caso, vse traza contra v / [S]. En la tercera representación lineal común, la gráfica de Hanes-Woolf , [S] / v se representa frente a [S]. En general, la normalización de datos puede ayudar a disminuir la cantidad de trabajo experimental y puede aumentar la confiabilidad de la salida, y es adecuada para análisis gráficos y numéricos. ^[23]

Significado práctico de las constantes cinéticas

El estudio de la cinética enzimática es importante por dos razones básicas. En primer lugar, ayuda a explicar cómo funcionan las enzimas y, en segundo lugar, ayuda a predecir cómo se comportan las enzimas en los organismos vivos. Las constantes cinéticas definidas anteriormente, K _M y V _max , son críticas para los intentos de comprender cómo las enzimas trabajan juntas para controlar el metabolismo .

Hacer estas predicciones no es trivial, incluso para sistemas simples. Por ejemplo, el oxalacetato está formado por malato deshidrogenasa dentro de la mitocondria . El oxalacetato puede luego ser consumido por citrato sintasa , fosfoenolpiruvato carboxiquinasa o aspartato aminotransferasa , alimentándose en el ciclo del ácido cítrico , gluconeogénesis o ácido aspártico.biosíntesis, respectivamente. Ser capaz de predecir cuánto oxaloacetato entra en cada vía requiere conocer la concentración de oxaloacetato, así como la concentración y la cinética de cada una de estas enzimas. Este objetivo de predecir el comportamiento de las vías metabólicas alcanza su expresión más compleja en la síntesis de enormes cantidades de datos cinéticos y de expresión génica en modelos matemáticos de organismos completos. Alternativamente, una simplificación útil del problema del modelado metabólico es ignorar la cinética de la enzima subyacente y solo confiar en la información sobre la estequiometría de la red de reacción, una técnica llamada análisis de balance de flujo . ^{[24] [25]}

Cinética de Michaelis-Menten con intermedio

También se podría considerar el caso menos simple

${\displaystyle {\ce {{E}+S<=>[k_{1}][k_{-1}]ES->[k_{2}]EI->[k_{3}]{E}+P}}}$

donde existe un complejo con la enzima y un intermedio y el intermedio se convierte en producto en un segundo paso. En este caso tenemos una ecuación muy similar ^[26]

${\displaystyle v_{0}=k_{cat}{\frac {{\ce {[S] [E]_0}}}{K_{M}^{\prime }+{\ce {[S]}}}}}$

pero las constantes son diferentes

${\displaystyle {\begin{aligned}K_{M}^{\prime }\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\frac {k_{3}}{k_{2}+k_{3}}}K_{M}={\frac {k_{3}}{k_{2}+k_{3}}}\cdot {\frac {k_{2}+k_{-1}}{k_{1}}}\\k_{cat}\ &{\stackrel {\mathrm {def} }{=}}\ {\dfrac {k_{3}k_{2}}{k_{2}+k_{3}}}\end{aligned}}}$

Vemos que para el caso límite , por lo tanto, cuando el último paso de es mucho más rápido que el paso anterior, obtenemos nuevamente la ecuación original. Matemáticamente tenemos entonces y .${\displaystyle k_{3}\gg k_{2}}$${\displaystyle {\ce {EI -> E + P}}}$${\displaystyle K_{M}^{\prime }\approx K_{M}}$${\displaystyle k_{cat}\approx k_{2}}$

Reacciones de múltiples sustratos

Las reacciones de múltiples sustratos siguen ecuaciones de velocidad complejas que describen cómo se unen los sustratos y en qué secuencia. El análisis de estas reacciones es mucho más sencillo si la concentración de sustrato A se mantiene constante y el sustrato B varía. En estas condiciones, la enzima se comporta como una enzima de un solo sustrato y una gráfica de v por [S] da constantes aparentes de K _M y V _max para el sustrato B. Si un conjunto de estas mediciones se realiza a diferentes concentraciones fijas de A, estos datos se pueden utilizar para averiguar cuál es el mecanismo de la reacción. Para una enzima que toma dos sustratos A y B y los convierte en dos productos P y Q, existen dos tipos de mecanismos: complejo ternario y ping-pong.

Mecanismos del complejo ternario

Mecanismo de complejo ternario de orden aleatorio para una reacción enzimática. La ruta de reacción se muestra como una línea y los intermedios enzimáticos que contienen los sustratos A y B o los productos P y Q se escriben debajo de la línea.

En estas enzimas, ambos sustratos se unen a la enzima al mismo tiempo para producir un complejo ternario EAB. El orden de unión puede ser aleatorio (en un mecanismo aleatorio) o los sustratos deben unirse en una secuencia particular (en un mecanismo ordenado). Cuando un conjunto de curvas v por [S] (fijo A, variable B) de una enzima con un mecanismo de complejo ternario se traza en un gráfico de Lineweaver-Burk , el conjunto de líneas producidas se intersecará.

Las enzimas con mecanismos de complejo ternario incluyen glutatión S- transferasa , ^[27] dihidrofolato reductasa ^[28] y ADN polimerasa . ^[29] Los siguientes enlaces muestran animaciones breves de los mecanismos del complejo ternario de las enzimas dihidrofolato reductasa ^[β] y ADN polimerasa ^[γ] .

Mecanismos de ping-pong

${\displaystyle {\ce {\overset {}{E->[{\ce {A \atop \downarrow }}]EA<=>E^{\ast }P->[{\ce {P \atop \uparrow }}]E^{\ast }->[{\ce {B \atop \downarrow }}]E^{\ast }B<=>EQ->[{\ce {Q \atop \uparrow }}]E}}}}$

Mecanismo de ping-pong para una reacción enzimática. Los intermedios contienen sustratos A y B o productos P y Q.

Como se muestra a la derecha, las enzimas con un mecanismo de ping-pong pueden existir en dos estados, E y una forma químicamente modificada de la enzima E *; esta enzima modificada se conoce como intermedio . En tales mecanismos, el sustrato A se une, cambia la enzima a E *, por ejemplo, transfiriendo un grupo químico al sitio activo y luego se libera. Solo después de que se libera el primer sustrato, el sustrato B puede unirse y reaccionar con la enzima modificada, regenerando la forma E no modificada. Cuando se traza un conjunto de curvas v por [S] (fijo A, variable B) de una enzima con un mecanismo de ping-pong en un gráfico de Lineweaver-Burk, se producirá un conjunto de líneas paralelas. Esto se llama trama secundaria .

Las enzimas con mecanismos de ping-pong incluyen algunas oxidorreductasas como la tiorredoxina peroxidasa , ^[30] transferasas como la acilneuraminato citidililtransferasa ^[31] y serina proteasas como la tripsina y la quimotripsina . ^{[32] Las} serina proteasas son una familia de enzimas muy común y diversa, incluidas las enzimas digestivas (tripsina, quimotripsina y elastasa), varias enzimas de la cascada de coagulación sanguínea y muchas otras. En estas serina proteasas, el intermedio E * es una especie de acil-enzima formada por el ataque de un residuo de serina del sitio activo en unenlace peptídico en un sustrato proteico. Aquí se enlaza una breve animación que muestra el mecanismo de la quimotripsina. ^[δ]

Catálisis reversible y la ecuación de Haldane

Los factores externos pueden limitar la capacidad de una enzima para catalizar una reacción en ambas direcciones (mientras que la naturaleza de un catalizador en sí misma significa que no puede catalizar solo una dirección, de acuerdo con el principio de reversibilidad microscópica ). Consideramos el caso de una enzima que cataliza la reacción en ambas direcciones:

${\displaystyle {\ce {{E}+{S}<=>[k_{1}][k_{-1}]ES<=>[k_{2}][k_{-2}]{E}+{P}}}}$

La velocidad inicial de la reacción en estado estacionario es ${\displaystyle v_{0}={\frac {d\,[{\rm {P}}]}{dt}}={\frac {(k_{1}k_{2}\,[{\rm {S}}]-k_{-1}k_{-2}[{\rm {P}}])[{\rm {E}}]_{0}}{k_{-1}+k_{2}+k_{1}\,[{\rm {S}}]+k_{-2}\,[{\rm {P}}]}}}$

${\displaystyle v_{0}}$es positivo si la reacción avanza hacia adelante ( ) y negativo en caso contrario.${\displaystyle S\rightarrow P}$

El equilibrio requiere eso , que ocurre cuando . Esto muestra que la termodinámica fuerza una relación entre los valores de las 4 constantes de velocidad.${\displaystyle v=0}$${\displaystyle {\frac {[{\rm {P}}]_{\rm {eq}}}{[{\rm {S}}]_{\rm {eq}}}}={\frac {k_{1}k_{2}}{k_{-1}k_{-2}}}=K_{\rm {eq}}}$

Los valores de los adelante y hacia atrás máximas tasas, obtenidos para , y , respectivamente, son y , respectivamente. Su razón no es igual a la constante de equilibrio, lo que implica que la termodinámica no restringe la razón de las tasas máximas. Esto explica que las enzimas pueden ser mucho "mejores catalizadores" ( en términos de velocidades máximas ) en una dirección particular de la reacción. ^[33]${\displaystyle [{\rm {S}}]\rightarrow \infty }$${\displaystyle [{\rm {P}}]=0}$${\displaystyle [{\rm {S}}]=0}$${\displaystyle [{\rm {P}}]\rightarrow \infty }$${\displaystyle V_{\rm {max}}^{f}=k_{2}{\rm {[E]}}_{tot}}$${\displaystyle V_{\rm {max}}^{b}=-k_{-1}{\rm {[E]}}_{tot}}$

On también puede derivar las dos constantes de Michaelis y . La ecuación de Haldane es la relación .${\displaystyle K_{M}^{S}=(k_{-1}+k_{2})/k_{1}}$${\displaystyle K_{M}^{P}=(k_{-1}+k_{2})/k_{-2}}$${\displaystyle K_{\rm {eq}}={\frac {[{\rm {P}}]_{\rm {eq}}}{[{\rm {S}}]_{\rm {eq}}}}={\frac {V_{\rm {max}}^{f}/K_{M}^{S}}{V_{\rm {max}}^{b}/K_{M}^{P}}}}$

Por lo tanto, la termodinámica restringe la relación entre los valores hacia adelante y hacia atrás , no la relación de valores.${\displaystyle V_{\rm {max}}/K_{M}}$${\displaystyle V_{\rm {max}}}$

Cinética de Non-Michaelis-Menten

Artículo principal: Regulación alostérica

Curva de saturación para una reacción enzimática que muestra cinética sigmoidea.

Muchos sistemas enzimáticos diferentes siguen un comportamiento distinto de Michaelis-Menten. ^[34] Unos pocos ejemplos seleccionados incluyen la cinética de enzimas autocatalíticas, enzimas cooperativas y alostéricas, enzimas interfaciales e intracelulares, enzimas procesivas, etc. Algunas enzimas producen un gráfico sigmoide v por [S], que a menudo indica la unión cooperativa del sustrato al sitio activo. Esto significa que la unión de una molécula de sustrato afecta la unión de las siguientes moléculas de sustrato. Este comportamiento es más común en enzimas multiméricas con varios sitios activos que interactúan. ^{[35] [36]} Aquí, el mecanismo de cooperación es similar al de la hemoglobina, con la unión del sustrato a un sitio activo alterando la afinidad de los otros sitios activos por las moléculas del sustrato. La cooperatividad positiva se produce cuando la unión de la primera molécula de sustrato aumenta la afinidad de los otros sitios activos por el sustrato. La cooperatividad negativa se produce cuando la unión del primer sustrato disminuye la afinidad de la enzima por otras moléculas de sustrato.

Las enzimas alostéricas incluyen tirosil tRNA-sintetasa de mamíferos, que muestra cooperatividad negativa, ^[37] y aspartato transcarbamoilasa bacteriana ^[38] y fosfofructoquinasa , ^[39] que muestran cooperatividad positiva.

La cooperatividad es sorprendentemente común y puede ayudar a regular las respuestas de las enzimas a los cambios en las concentraciones de sus sustratos. ^[35] La cooperatividad positiva hace que las enzimas sean mucho más sensibles a [S] y sus actividades pueden mostrar grandes cambios en un rango estrecho de concentración de sustrato. Por el contrario, la cooperatividad negativa hace que las enzimas sean insensibles a pequeños cambios en [S].

La ecuación de Hill (bioquímica) ^[40] se utiliza a menudo para describir el grado de cooperatividad cuantitativamente en cinéticas distintas de Michaelis-Menten. El coeficiente n de Hill derivado mide cuánto afecta la unión del sustrato a un sitio activo a la unión del sustrato a los otros sitios activos. Un coeficiente de Hill de <1 indica cooperatividad negativa y un coeficiente de> 1 indica cooperatividad positiva .

Cinética preestablecida

Curva de progreso del estado preestablecido, que muestra la fase de explosión de una reacción enzimática.

En el primer momento después de que una enzima se mezcla con el sustrato, no se ha formado ningún producto y no existen productos intermedios . El estudio de los siguientes milisegundos de la reacción se denomina cinética previa al estado estacionario. Por lo tanto, la cinética anterior al estado estacionario se ocupa de la formación y el consumo de intermediarios enzima-sustrato (como ES o E *) hasta que se alcanzan sus concentraciones en el estado estacionario .

Este enfoque se aplicó primero a la reacción de hidrólisis catalizada por quimotripsina . ^[41] A menudo, la detección de un intermedio es una evidencia vital en las investigaciones de qué mecanismo sigue una enzima. Por ejemplo, en los mecanismos de ping-pong que se muestran arriba, las mediciones cinéticas rápidas pueden seguir la liberación del producto P y medir la formación del intermedio enzimático modificado E *. ^[42] En el caso de la quimotripsina, este intermedio está formado por un ataque al sustrato por la serina nucleofílica en el sitio activo y la formación del intermedio acil-enzima.

En la figura de la derecha, la enzima produce E * rápidamente en los primeros segundos de la reacción. Luego, la velocidad disminuye a medida que se alcanza el estado estable. Esta fase de explosión rápida de la reacción mide un solo recambio de la enzima. En consecuencia, la cantidad de producto liberado en esta ráfaga, que se muestra como la intersección en el eje y del gráfico, también da la cantidad de enzima funcional que está presente en el ensayo. ^[43]

Mecanismo químico

Un objetivo importante de la medición de la cinética enzimática es determinar el mecanismo químico de una reacción enzimática, es decir, la secuencia de pasos químicos que transforman el sustrato en producto. Los enfoques cinéticos discutidos anteriormente mostrarán a qué tasas se forman e interconvierten los intermedios , pero no pueden identificar exactamente qué son estos intermedios.

Las mediciones cinéticas tomadas en diversas condiciones de solución o en enzimas o sustratos ligeramente modificados a menudo arrojan luz sobre este mecanismo químico, ya que revelan el paso o los intermedios determinantes de la velocidad en la reacción. Por ejemplo, la ruptura de un enlace covalente a un átomo de hidrógeno es un paso común que determina la velocidad. Puede mostrarse cuál de las posibles transferencias de hidrógeno determina la velocidad midiendo los efectos cinéticos de sustituir cada hidrógeno por deuterio , su isótopo estable . La velocidad cambiará cuando se reemplace el hidrógeno crítico, debido a un efecto de isótopo cinético primario , que se produce porque los enlaces al deuterio son más difíciles de romper que los enlaces al hidrógeno. ^[44]También es posible medir efectos similares con otras sustituciones de isótopos, como ¹³ C / ¹² C y ¹⁸ O / ¹⁶ O, pero estos efectos son más sutiles. ^[45]

Los isótopos también se pueden usar para revelar el destino de varias partes de las moléculas del sustrato en los productos finales. Por ejemplo, a veces es difícil discernir el origen de un átomo de oxígeno en el producto final; ya que puede provenir del agua o de parte del sustrato. Esto puede determinarse sustituyendo sistemáticamente el isótopo estable ¹⁸ O del oxígeno en las diversas moléculas que participan en la reacción y comprobando el isótopo en el producto. ^[46] El mecanismo químico también se puede dilucidar examinando la cinética y los efectos isotópicos en diferentes condiciones de pH, ^[47] alterando los iones metálicos u otros cofactores unidos , ^[48] mediantemutagénesis dirigida al sitio de residuos de aminoácidos conservados, o mediante el estudio del comportamiento de la enzima en presencia de análogos del sustrato (s). ^[49]

Inhibición y activación de enzimas

Artículo principal: inhibidor de enzimas

Esquema cinético para inhibidores enzimáticos reversibles.

Los inhibidores enzimáticos son moléculas que reducen o anulan la actividad enzimática, mientras que los activadores enzimáticos son moléculas que aumentan la tasa catalítica de las enzimas. Estas interacciones pueden ser reversibles (es decir, la eliminación del inhibidor restaura la actividad enzimática) o irreversibles (es decir, el inhibidor inactiva permanentemente la enzima).

Inhibidores reversibles

Los inhibidores de enzimas tradicionalmente reversibles se han clasificado como competitivos , no competitivos o no competitivos , según sus efectos sobre K _M y V _max.. Estos diferentes efectos resultan de la unión del inhibidor a la enzima E, al complejo enzima-sustrato ES, oa ambos, respectivamente. La división de estas clases surge de un problema en su derivación y da como resultado la necesidad de usar dos constantes de enlace diferentes para un evento de enlace. La unión de un inhibidor y su efecto sobre la actividad enzimática son dos cosas claramente diferentes, otro problema que las ecuaciones tradicionales no reconocen. En la inhibición no competitiva, la unión del inhibidor da como resultado una inhibición del 100% de la enzima únicamente y no considera la posibilidad de algo intermedio. ^[50] En la inhibición no competitiva, el inhibidor se unirá a una enzima en su sitio alostérico; por lo tanto, la afinidad de unión, o inversa de K _M, del sustrato con la enzima permanecerá igual. Por otro lado, la V _max disminuirá en relación con una enzima no inhibida. En un gráfico de Lineweaver-Burk, la presencia de un inhibidor no competitivo se ilustra mediante un cambio en la intersección con el eje y, definido como 1 / V _máx . La intersección con el eje x, definida como −1 / K _M , seguirá siendo la misma. En la inhibición competitiva, el inhibidor se unirá a una enzima en el sitio activo, compitiendo con el sustrato. Como resultado, la K _M aumentará y la V _max permanecerá igual. ^[51]La forma común del término inhibidor también oculta la relación entre la unión del inhibidor a la enzima y su relación con cualquier otro término de unión, ya sea la ecuación de Michaelis-Menten o una curva de respuesta a la dosis asociada con la unión al receptor del ligando. Para demostrar la relación, se puede realizar la siguiente reordenación:

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{1+{\cfrac {[I]}{K_{i}}}}}={\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {[I]+K_{i}}{K_{i}}}}}$

Añadiendo cero al final ([I] - [I])

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {[I]+K_{i}}{[I]+K_{i}-[I]}}}}$

Dividiendo entre [I] + K _i

${\displaystyle {\cfrac {V_{\max }}{\cfrac {1}{1-{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}}}=V_{\max }-V_{\max }{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

Esta notación demuestra que similar a la ecuación de Michaelis-Menten, donde la velocidad de reacción depende del porcentaje de la población de enzimas que interactúa con el sustrato, el efecto del inhibidor es el resultado del porcentaje de la población de enzimas que interactúa con el inhibidor. El único problema con esta ecuación en su forma actual es que supone una inhibición absoluta de la enzima con la unión del inhibidor, cuando de hecho puede haber una amplia gama de efectos desde el 100% de inhibición de la rotación del sustrato hasta apenas> 0%. Para tener en cuenta esto, la ecuación se puede modificar fácilmente para permitir diferentes grados de inhibición al incluir un término delta V _máx .

${\displaystyle V_{\max }-\Delta V_{\max }{\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

o

${\displaystyle V_{\max 1}-(V_{\max 1}-V_{\max 2}){\cfrac {[I]}{[I]+K_{i}}}}$

Este término puede entonces definir la actividad enzimática residual presente cuando el inhibidor interactúa con enzimas individuales en la población. Sin embargo, la inclusión de este término tiene el valor agregado de permitir la posibilidad de activación si el término secundario V _max resulta ser mayor que el término inicial. Para tener en cuenta también la posibilidad de activación, la notación se puede reescribir reemplazando el inhibidor "I" con un término modificador denotado aquí como "X".

${\displaystyle V_{\max 1}-(V_{\max 1}-V_{\max 2}){\cfrac {[X]}{[X]+K_{x}}}}$

Mientras que esta terminología resultados de una manera simplificada de tratar con efectos cinéticos relativos a la velocidad máxima de la ecuación de Michaelis-Menten, pone de relieve los problemas potenciales con el término utilizado para describir los efectos relativos a la K _M . El K _M con respecto a la afinidad de la enzima para el sustrato debería en la mayoría de los casos se refieren a los cambios potenciales en el sitio de unión de la enzima que daría lugar directamente a partir de la enzima de interacciones de inhibidor. Como tal, un término similar al propuesto anteriormente para modular V _max debería ser apropiado en la mayoría de las situaciones: ^[52]

${\displaystyle K_{m1}-(K_{m1}-K_{m2}){\cfrac {[X]}{[X]+K_{x}}}}$

En los siguientes artículos se han analizado algunos ejemplos de inhibición reversible pertenecientes a los modelos competitivo y no competitivo. ^{[53] [54] [55]}

Inhibidores irreversibles

Los inhibidores enzimáticos también pueden inactivar enzimas de forma irreversible, normalmente modificando covalentemente los residuos del sitio activo. Estas reacciones, que pueden denominarse sustratos suicidas, siguen funciones de desintegración exponencial y suelen ser saturables. Por debajo de la saturación, siguen una cinética de primer orden con respecto al inhibidor. La inhibición irreversible podría clasificarse en dos tipos distintos. El marcaje de afinidad es un tipo de inhibición irreversible en la que un grupo funcional que es altamente reactivo modifica un residuo catalíticamente crítico en la proteína de interés para provocar la inhibición. La inhibición basada en mecanismos, por otro lado, implica la unión del inhibidor seguida de alteraciones mediadas por enzimas que transforman a este último en un grupo reactivo que modifica irreversiblemente la enzima.

Discurso filosófico sobre la reversibilidad e irreversibilidad de la inhibición

Habiendo discutido la inhibición reversible y la inhibición irreversible en los dos títulos anteriores, debería señalarse que el concepto de reversibilidad (o irreversibilidad) es una construcción puramente teórica que depende exclusivamente del marco de tiempo del ensayo, es decir, un ensayo reversible. que implica la asociación y disociación de la molécula inhibidora en escalas de tiempo diminutas parecería irreversible si un ensayo evalúa el resultado en segundos y viceversa. Existe un continuo de comportamientos de inhibidores que abarcan la reversibilidad y la irreversibilidad en un marco de tiempo de ensayo no arbitrario dado. Hay inhibidores que muestran un comportamiento de inicio lento ^[53] y la mayoría de estos inhibidores, invariablemente, también muestran una unión estrecha a la proteína diana de interés. ^{[53] [54]}

Mecanismos de catálisis

Artículo principal: Catálisis enzimática

La variación de energía en función de la coordenada de reacción muestra la estabilización del estado de transición por una enzima.

El modelo preferido para la interacción enzima-sustrato es el modelo de ajuste inducido. ^[56] Este modelo propone que la interacción inicial entre la enzima y el sustrato es relativamente débil, pero que estas interacciones débiles inducen rápidamente cambios conformacionales en la enzima que fortalecen la unión. Estos cambios conformacionales también acercan los residuos catalíticos en el sitio activo a los enlaces químicos en el sustrato que serán alterados en la reacción. ^[57] Los cambios conformacionales se pueden medir utilizando dicroísmo circular o interferometría de polarización dual . Después de que tiene lugar la unión, uno o más mecanismos de catálisis reducen la energía del estado de transición de la reacción.proporcionando una vía química alternativa para la reacción. Los mecanismos de catálisis incluyen catálisis por tensión de enlace; por proximidad y orientación; por donantes o aceptores de protones de sitio activo; catálisis covalente y tunelización cuántica . ^{[42] [58]}

La cinética enzimática no puede probar qué modos de catálisis utiliza una enzima. Sin embargo, algunos datos cinéticos pueden sugerir posibilidades de ser examinados por otras técnicas. Por ejemplo, un mecanismo de ping-pong con cinética de estado estacionario previo a la fase de explosión sugeriría que la catálisis covalente podría ser importante en el mecanismo de esta enzima. Alternativamente, la observación de un fuerte efecto del pH en V _max pero no en K _M podría indicar que un residuo en el sitio activo necesita estar en un estado de ionización particular para que ocurra la catálisis.

Historia

En 1902, Victor Henri propuso una teoría cuantitativa de la cinética enzimática, ^[59] pero en ese momento aún no se reconocía la importancia experimental de la concentración de iones de hidrógeno . Después de que Peter Lauritz Sørensen definiera la escala de pH logarítmica e introdujera el concepto de amortiguación en 1909 ^[60], la química alemana Leonor Michaelis y la Dra. Maud Leonora Menten (investigadora postdoctoral en el laboratorio de Michaelis en ese momento) repitieron los experimentos de Henri y confirmaron su ecuación, que ahora se conoce generalmente como cinética de Michaelis-Menten (a veces también cinética de Henri-Michaelis-Menten). ^[61] Su trabajo fue desarrollado aún más por GE Briggs y JBS Haldane , quienes derivaron ecuaciones cinéticas que todavía se consideran ampliamente hoy en día como un punto de partida en el modelado de la actividad enzimática. ^[62]

La principal contribución del enfoque de Henri-Michaelis-Menten fue pensar en las reacciones enzimáticas en dos etapas. En el primero, el sustrato se une reversiblemente a la enzima, formando el complejo enzima-sustrato. A esto a veces se le llama complejo de Michaelis. Luego, la enzima cataliza el paso químico de la reacción y libera el producto. La cinética de muchas enzimas se describe adecuadamente mediante el modelo simple de Michaelis-Menten, pero todas las enzimas tienen movimientos internos que no se tienen en cuenta en el modelo y pueden tener contribuciones significativas a la cinética general de la reacción. Esto se puede modelar mediante la introducción de varias vías de Michaelis-Menten que están conectadas con tasas fluctuantes, ^{[63] [64] [65]}que es una extensión matemática del mecanismo básico de Michaelis Menten. ^[66]

Software

ENZO (Enzyme Kinetics) es una herramienta de interfaz gráfica para construir modelos cinéticos de reacciones catalizadas por enzimas. ENZO genera automáticamente las ecuaciones diferenciales correspondientes a partir de un esquema de reacción enzimático estipulado. Estas ecuaciones diferenciales son procesadas por un solucionador numérico y un algoritmo de regresión que ajusta los coeficientes de las ecuaciones diferenciales a las curvas del curso del tiempo observadas experimentalmente. ENZO permite una evaluación rápida de los esquemas de reacción rivales y se puede utilizar para pruebas de rutina en cinética enzimática. ^[67]

Ver también

• Dinámica proteica
• Enzima limitada por difusión
• Modelo de adsorción de Langmuir

Notas al pie

α. ^ Enlace: Tutorial interactivo de cinética de Michaelis-Menten (se requiere Java)

β. ^ Enlace: mecanismo de dihidrofolato reductasa (Gif)

γ. ^ Enlace: mecanismo de la ADN polimerasa (Gif)

δ. ^ Enlace: Mecanismo de quimotripsina (se requiere Flash)

Referencias

1. Wrighton MS, Ebbing DD (1993). Química general (4ª ed.). Boston: Houghton Mifflin. ISBN 978-0-395-63696-1.
2. Srinivasan, Bharath (27 de septiembre de 2020). "Palabras de consejo: enseñanza de la cinética enzimática" . La revista FEBS . 288 (7): 2068–2083. doi : 10.1111 / febs.15537 . ISSN 1742-464X . PMID 32981225 .  
3. Fromm HJ, Hargrove MS (2012) Cinética enzimática. En: Fundamentos de la bioquímica. Springer, Berlín, Heidelberg
4. Danson M, Eisenthal R (2002). Ensayos de enzimas: un enfoque práctico . Oxford [Oxfordshire]: Oxford University Press. ISBN 978-0-19-963820-8.
5. Xie XS, Lu HP (junio de 1999). "Enzimología de molécula única" . La revista de química biológica . 274 (23): 15967–70. doi : 10.1074 / jbc.274.23.15967 . PMID 10347141 . 
6. Lu HP (junio de 2004). "Estudios de espectroscopia de molécula única de dinámica de cambio conformacional en reacciones enzimáticas". Biotecnología Farmacéutica Actual . 5 (3): 261–9. doi : 10.2174 / 1389201043376887 . PMID 15180547 . 
7. Schnell JR, Dyson HJ , Wright PE (2004). "Estructura, dinámica y función catalítica de la dihidrofolato reductasa". Revisión anual de biofísica y estructura biomolecular . 33 : 119–40. doi : 10.1146 / annurev.biophys.33.110502.133613 . PMID 15139807 . 
8. Gibson QH (1969). "[6] Mezcla rápida: flujo detenido". Mezcla rápida: flujo detenido . Métodos en enzimología. 16 . págs. 187–228. doi : 10.1016 / S0076-6879 (69) 16009-7 . ISBN 978-0-12-181873-9.
9. Duggleby RG (1995). "[3] Análisis de las curvas de progreso enzimático por regresión no lineal". Análisis de las curvas de progreso enzimático mediante regresión no lineal . Métodos en enzimología. 249 . págs. 61–90. doi : 10.1016 / 0076-6879 (95) 49031-0 . ISBN 978-0-12-182150-0. PMID  7791628 .
10. Murray JB, Dunham CM, Scott WG (enero de 2002). "Un cambio conformacional dependiente del pH, en lugar del paso químico, parece ser un factor limitante en la reacción de escisión de ribozimas de cabeza de martillo". Revista de Biología Molecular . 315 (2): 121-30. doi : 10.1006 / jmbi.2001.5145 . PMID 11779233 . S2CID 18102624 .  
11. Michaelis L. y Menten ML Kinetik der Invertinwirkung Biochem. Z. 1913; 49: 333–369 traducción al inglés Consultado el 6 de abril de 2007
12. Srinivasan, Bharat. "Una guía para la ecuación de Michaelis-Menten: estado estacionario y más allá" . La revista FEBS . n / a (n / a). doi : 10.1111 / febs.16124 . ISSN 1742-4658 . 
13. Stroppolo ME, Falconi M, Caccuri AM, Desideri A (septiembre de 2001). "Enzimas supereficientes". Ciencias de la vida celular y molecular . 58 (10): 1451–60. doi : 10.1007 / PL00000788 . PMID 11693526 . S2CID 24874575 .  
14. Bar-Even A, Noor E, Savir Y, Liebermeister W, Davidi D, Tawfik DS, Milo R (mayo de 2011). "La enzima moderadamente eficiente: tendencias evolutivas y fisicoquímicas que configuran los parámetros de la enzima". Bioquímica . 50 (21): 4402–10. doi : 10.1021 / bi2002289 . PMID 21506553 . 
15. Walsh R, Martin E, Darvesh S (enero de 2010). "Un método para describir reacciones catalizadas por enzimas mediante la combinación de parámetros cinéticos enzimáticos de estado estacionario y de curso temporal". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Temas generales . 1800 (1): 1–5. doi : 10.1016 / j.bbagen.2009.10.007 . PMID 19840832 . 
16. Beal SL (diciembre de 1983). "Cálculo de la solución explícita a la ecuación de Michaelis-Menten". Revista de Farmacocinética y Biofarmacéutica . 11 (6): 641–57. doi : 10.1007 / BF01059062 . PMID 6689584 . S2CID 32571415 .  
17. Schnell S, Mendoza C (1997). "Solución de forma cerrada para cinética enzimática dependiente del tiempo". Revista de Biología Teórica . 187 (2): 207–212. doi : 10.1006 / jtbi.1997.0425 .
18. Goudar CT, Sonnad JR, Duggleby RG (enero de 1999). "Estimación de parámetros mediante una solución directa de la ecuación integrada de Michaelis-Menten" (PDF) . Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Estructura de proteínas y enzimología molecular . 1429 (2): 377–83. doi : 10.1016 / s0167-4838 (98) 00247-7 . PMID 9989222 . Archivado desde el original (PDF) el 9 de noviembre de 2015.  
19. Goudar CT, Harris SK, McInerney MJ, Suflita JM (diciembre de 2004). "Análisis de la curva de progreso para reacciones cinéticas enzimáticas y microbianas utilizando soluciones explícitas basadas en la función W de Lambert". Revista de métodos microbiológicos . 59 (3): 317–26. doi : 10.1016 / j.mimet.2004.06.013 . PMID 15488275 . 
20. Berberan-Santos MN (2010). "Un tratamiento general de la cinética enzimática de Henri Michaelis Menten: solución de serie exacta y soluciones analíticas aproximadas" (PDF) . MATCH Comunicaciones en Matemáticas y Química Informática . 63 : 283.
21. Jones ME (diciembre de 1992). "Análisis de estimadores de mínimos cuadrados ponderados algebraicos para parámetros enzimáticos" . La revista bioquímica . 288 (Parte 2): 533–8. doi : 10.1042 / bj2880533 . PMC 1132043 . PMID 1463456 .  
22. Tseng SJ, Hsu JP (agosto de 1990). "Una comparación de los procedimientos de estimación de parámetros para el modelo de Michaelis-Menten". Revista de Biología Teórica . 145 (4): 457–64. doi : 10.1016 / S0022-5193 (05) 80481-3 . PMID 2246896 . 
23. Bravo IG, Busto F, De Arriaga D, Ferrero MA, Rodríguez-Aparicio LB, Martínez-Blanco H, Reglero A (septiembre de 2001). "Una trama normalizada como una herramienta novedosa y que ahorra tiempo en el análisis cinético enzimático complejo" . La revista bioquímica . 358 (Pt 3): 573–83. doi : 10.1042 / bj3580573 . PMC 1222113 . PMID 11577687 .  
24. Almaas E, Kovács B, Vicsek T, Oltvai ZN, Barabási AL (febrero de 2004). "Organización global de flujos metabólicos en la bacteria Escherichia coli". Naturaleza . 427 (6977): 839–43. arXiv : q-bio / 0403001 . Código Bibliográfico : 2004Natur.427..839A . doi : 10.1038 / nature02289 . PMID 14985762 . S2CID 715721 .  
25. Reed JL, Vo TD, Schilling CH, Palsson BO (2003). "Un modelo de escala de genoma ampliado de Escherichia coli K-12 (iJR904 GSM / GPR)" . Biología del genoma . 4 (9): R54. doi : 10.1186 / gb-2003-4-9-r54 . PMC 193654 . PMID 12952533 .  
26. para obtener una derivación completa, consulte aquí
27. Dirr H, Reinemer P, Huber R (marzo de 1994). "Estructuras cristalinas de rayos X de glutatión S-transferasas citosólicas. Implicaciones para la arquitectura de proteínas, reconocimiento de sustrato y función catalítica" . Revista europea de bioquímica . 220 (3): 645–61. doi : 10.1111 / j.1432-1033.1994.tb18666.x . PMID 8143720 . 
28. Stone SR, Morrison JF (julio de 1988). "Dihidrofolato reductasa de Escherichia coli: el mecanismo cinético con NADPH y fosfato de dinucleótido de acetilpiridina adenina reducido como sustratos". Bioquímica . 27 (15): 5493–9. doi : 10.1021 / bi00415a016 . PMID 3052577 . 
29. Fisher PA (1994). Mecanismo enzimológico de las ADN polimerasas replicativas en eucariotas superiores . Avances en investigación de ácidos nucleicos y biología molecular. 47 . págs.  371–97 . doi : 10.1016 / S0079-6603 (08) 60257-3 . ISBN 978-0-12-540047-3. PMID  8016325 .
30. Akerman SE, Müller S (agosto de 2003). "2-Cys peroxiredoxin PfTrx-Px1 está involucrado en la defensa antioxidante de Plasmodium falciparum". Parasitología molecular y bioquímica . 130 (2): 75–81. doi : 10.1016 / S0166-6851 (03) 00161-0 . PMID 12946843 . 
31. Bravo IG, Barrallo S, Ferrero MA, Rodríguez-Aparicio LB, Martínez-Blanco H, Reglero A (septiembre de 2001). "Propiedades cinéticas de la acilneuraminato citidililtransferasa de Pasteurella haemolytica A2" . La revista bioquímica . 358 (Pt 3): 585–98. doi : 10.1042 / bj3580585 . PMC 1222114 . PMID 11577688 .  
32. Kraut J (1977). "Serina proteasas: estructura y mecanismo de catálisis". Revisión anual de bioquímica . 46 : 331–58. doi : 10.1146 / annurev.bi.46.070177.001555 . PMID 332063 . 
33. Cornish-Bowden A (2012). Fundamentos de la cinética enzimática . Wiley-Blackwell. Algunas enzimas son catalizadores mucho más eficaces en una dirección que en la otra. Como ejemplo sorprendente, la velocidad límite de la reacción directa catalizada por la metionina adenosiltransferasa es aproximadamente 10 ⁵ mayor que la de la dirección inversa, aunque la constante de equilibrio es cercana a la unidad (página 59).
34. Srinivasan, Bharat (2021). "Tratamiento explícito de cinética atípica y no Michaelis-Menten en el descubrimiento temprano de fármacos". ChemMedChem . 16 (6): 899–918. doi : 10.1002 / cmdc.202000791 . PMID 33231926 . S2CID 227157473 .  
35. Srinivasan, Bharat; Forouhar, Farhad; Shukla, Arpit; Sampangi, Chethana; Kulkarni, Sonia; Abashidze, Mariam; Seetharaman, Jayaraman; Lew, Scott; Mao, Lei; Acton, Thomas B .; Xiao, Rong (marzo de 2014). "Regulación alostérica y activación de sustrato en nucleotidasa II citosólica de Legionella pneumophila" . Diario FEBS . 281 (6): 1613–1628. doi : 10.1111 / febs.12727 . PMC 3982195 . PMID 24456211 .  
36. Ricard J, Cornish-Bowden A (julio de 1987). "Enzimas cooperativas y alostéricas: 20 años después" . Revista europea de bioquímica . 166 (2): 255–72. doi : 10.1111 / j.1432-1033.1987.tb13510.x . PMID 3301336 . 
37. Ward WH, Fersht AR (julio de 1988). "La tirosil-tRNA sintetasa actúa como un dímero asimétrico en la carga de tRNA. Una razón fundamental para la actividad de la mitad de los sitios". Bioquímica . 27 (15): 5525-30. doi : 10.1021 / bi00415a021 . PMID 3179266 . 
38. Helmstaedt K, Krappmann S, Braus GH (septiembre de 2001). "Regulación alostérica de la actividad catalítica: Escherichia coli aspartato transcarbamoilasa versus corismato mutasa de levadura" . Revisiones de Microbiología y Biología Molecular . 65 (3): 404–21, índice. doi : 10.1128 / MMBR.65.3.404-421.2001 . PMC 99034 . PMID 11528003 .  
39. Schirmer T, Evans PR (enero de 1990). "Base estructural del comportamiento alostérico de la fosfofructoquinasa". Naturaleza . 343 (6254): 140–5. Código Bibliográfico : 1990Natur.343..140S . doi : 10.1038 / 343140a0 . PMID 2136935 . S2CID 4272821 .  
40. Hill AV (1910). "Los posibles efectos de la agregación de las moléculas de hemoglobina sobre sus curvas de disociación". J. Physiol . 40 : iv – vii.
41. Hartley BS, Kilby BA (febrero de 1954). "La reacción de ésteres de p-nitrofenilo con quimotripsina e insulina" . La revista bioquímica . 56 (2): 288–97. doi : 10.1042 / bj0560288 . PMC 1269615 . PMID 13140189 .  
42. Fersht, Alan (1999). Estructura y mecanismo en la ciencia de las proteínas: una guía para la catálisis enzimática y el plegamiento de proteínas . San Francisco: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-3268-6.
43. Bender ML, Begué-Cantón ML, Blakeley RL, Brubacher LJ, Feder J, Gunter CR, Kézdy FJ, Killheffer JV, Marshall TH, Miller CG, Roeske RW, Stoops JK (diciembre de 1966). "Determinación de la concentración de soluciones de enzimas hidrolíticas: alfa-quimotripsina, tripsina, papaína, elastasa, subtilisina y acetilcolinesterasa". Revista de la Sociedad Química Estadounidense . 88 (24): 5890–913. doi : 10.1021 / ja00976a034 . PMID 5980876 . 
44. Cleland WW (enero de 2005). "El uso de efectos isotópicos para determinar mecanismos enzimáticos". Archivos de Bioquímica y Biofísica . 433 (1): 2–12. doi : 10.1016 / j.abb.2004.08.027 . PMID 15581561 . 
45. Northrop DB (1981). "La expresión de efectos isotópicos en reacciones catalizadas por enzimas". Revisión anual de bioquímica . 50 : 103–31. doi : 10.1146 / annurev.bi.50.070181.000535 . PMID 7023356 . 
46. Baillie TA, Rettenmeier AW (1986). "Biotransformación de fármacos: estudios mecanicistas con isótopos estables". Revista de farmacología clínica . 26 (6): 448–51. doi : 10.1002 / j.1552-4604.1986.tb03556.x . PMID 3734135 . S2CID 39193680 .  
47. Cleland WW (1982). "Uso de efectos isotópicos para dilucidar los mecanismos enzimáticos". Revisiones críticas de CRC en bioquímica . 13 (4): 385–428. doi : 10.3109 / 10409238209108715 . PMID 6759038 . 
48. Christianson DW, Cox JD (1999). "Catálisis por hidróxido activado por metales en metaloenzimas de zinc y manganeso". Revisión anual de bioquímica . 68 : 33–57. doi : 10.1146 / annurev.biochem.68.1.33 . PMID 10872443 . 
49. Kraut DA, Carroll KS, Herschlag D (2003). "Desafíos en el mecanismo enzimático y energético". Revisión anual de bioquímica . 72 : 517–71. doi : 10.1146 / annurev.biochem.72.121801.161617 . PMID 12704087 . 
50. Walsh R, Martin E, Darvesh S (diciembre de 2011). "Limitaciones de las clasificaciones de inhibidores convencionales". Biología integrativa . 3 (12): 1197–201. doi : 10.1039 / c1ib00053e . PMID 22038120 . 
51. Cleland WW (febrero de 1963). "La cinética de reacciones catalizadas por enzimas con dos o más sustratos o productos. III. Predicción de la velocidad inicial y patrones de inhibición por inspección". Biochimica et Biophysica Acta . 67 : 188–96. doi : 10.1016 / 0006-3002 (63) 91816-x . PMID 14021669 . 
52. Walsh R, Martin E, Darvesh S (mayo de 2007). "Una ecuación versátil para describir la inhibición enzimática reversible y la cinética de activación: modelado de beta-galactosidasa y butirilcolinesterasa". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Temas generales . 1770 (5): 733–46. doi : 10.1016 / j.bbagen.2007.01.001 . PMID 17307293 . 
53. Srinivasan B, Skolnick J (mayo de 2015). "Información sobre la inhibición de unión estrecha de inicio lento de la dihidrofolato reductasa de Escherichia coli: caracterización mecanicista detallada de pirrolo [3,2-f] quinazolina-1,3-diamina y sus derivados como nuevos inhibidores de unión estrecha" . La revista FEBS . 282 (10): 1922–38. doi : 10.1111 / febs.13244 . PMC 4445455 . PMID 25703118 .  
54. Srinivasan B, Tonddast-Navaei S, Skolnick J (octubre de 2015). "Estudios de unión de ligandos, relación estructura-actividad preliminar y caracterización mecanicista detallada de derivados de 1-fenil-6,6-dimetil-1,3,5-triazina-2,4-diamina como inhibidores de la dihidrofolato reductasa de Escherichia coli" . Revista europea de química medicinal . 103 : 600-14. doi : 10.1016 / j.ejmech.2015.08.021 . PMC 4610388 . PMID 26414808 .  
55. Srinivasan B, Rodrigues JV, Tonddast-Navaei S, Shakhnovich E, Skolnick J (julio de 2017). "Diseño racional de nuevos inhibidores de la dihidrofolato reductasa alostérica que muestran efectos antibacterianos en variantes de escape de Escherichia coli resistentes a fármacos" . Biología Química ACS . 12 (7): 1848–1857. doi : 10.1021 / acschembio.7b00175 . PMC 5819740 . PMID 28525268 .  
56. Koshland DE (febrero de 1958). "Aplicación de una teoría de la especificidad enzimática a la síntesis de proteínas" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 44 (2): 98-104. Código Bibliográfico : 1958PNAS ... 44 ... 98K . doi : 10.1073 / pnas.44.2.98 . PMC 335371 . PMID 16590179 .  
57. Hammes GG (julio de 2002). "Múltiples cambios conformacionales en catálisis enzimática". Bioquímica . 41 (26): 8221–8. doi : 10.1021 / bi0260839 . PMID 12081470 . 
58. Sutcliffe MJ, Scrutton NS (julio de 2002). "Un nuevo marco conceptual para la catálisis enzimática. Túnel de hidrógeno acoplado a la dinámica enzimática en las enzimas flavoproteínas y quinoproteínas" . Revista europea de bioquímica . 269 (13): 3096–102. doi : 10.1046 / j.1432-1033.2002.03020.x . PMID 12084049 . 
59. Enrique V (1902). "Theorie generale de l'action de quelques diastases". Compt. Desgarrar. Acad. Sci. París . 135 : 916–9.
60. Sørensen PL (1909). "Enzymstudien {II}. Über die Messung und Bedeutung der Wasserstoffionenkonzentration bei enzimatischen Prozessen" [Estudios enzimáticos III: sobre la medición y el significado de la concentración de iones de hidrógeno en procesos enzimáticos]. Biochem. Z. (en alemán). 21 : 131-304.
61. Michaelis L, Menten M (1913). "Die Kinetik der Invertinwirkung" [La cinética de la acción invertasa]. Biochem. Z. (en alemán). 49 : 333–369.; Michaelis L, Menten ML, Johnson KA, Goody RS (octubre de 2011). "La constante de Michaelis original: traducción del artículo de Michaelis-Menten de 1913" . Bioquímica . 50 (39): 8264–9. doi : 10.1021 / bi201284u . PMC 3381512 . PMID 21888353 .  
62. Briggs GE, Haldane JB (1925). "Una nota sobre la cinética de la acción de las enzimas" . La revista bioquímica . 19 (2): 338–9. doi : 10.1042 / bj0190338 . PMC 1259181 . PMID 16743508 .  
63. Flomenbom O, Velonia K, Loos D, Masuo S, Cotlet M, Engelborghs Y, Hofkens J, Rowan AE, Nolte RJ, Van der Auweraer M, de Schryver FC, Klafter J (febrero de 2005). "Desintegración exponencial estirada y correlaciones en la actividad catalítica de moléculas de lipasa individuales fluctuantes" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 102 (7): 2368–72. Código Bibliográfico : 2005PNAS..102.2368F . doi : 10.1073 / pnas.0409039102 . PMC 548972 . PMID 15695587 .  
64. Inglés BP, Min W, van Oijen AM, Lee KT, Luo G, Sun H, Cherayil BJ, Kou SC, Xie XS (febrero de 2006). "Moléculas de enzima única siempre fluctuantes: ecuación de Michaelis-Menten revisada". Biología química de la naturaleza . 2 (2): 87–94. doi : 10.1038 / nchembio759 . PMID 16415859 . S2CID 2201882 .  
65. Lu HP, Xun L, Xie XS (diciembre de 1998). "Dinámica enzimática de una sola molécula". Ciencia . 282 (5395): 1877–82. Código Bibliográfico : 1998Sci ... 282.1877P . doi : 10.1126 / science.282.5395.1877 . PMID 9836635 . 
66. Xue X, Liu F, Ou-Yang ZC (septiembre de 2006). "Ecuación de Michaelis-Menten de molécula única más allá del trastorno cuasiestático". Revisión E física . 74 (3 Pt 1): 030902. arXiv : cond-mat / 0604364 . Código Bibliográfico : 2006PhRvE..74c0902X . doi : 10.1103 / PhysRevE.74.030902 . PMID 17025584 . S2CID 41674948 .  
67. Bevc S, Konc J, Stojan J, Hodošček M, Penca M, Praprotnik M, Janežič D (2011). "ENZO: una herramienta web para la derivación y evaluación de modelos cinéticos de reacciones catalizadas por enzimas" . PLOS ONE . 6 (7): e22265. Código bibliográfico : 2011PLoSO ... 622265B . doi : 10.1371 / journal.pone.0022265 . PMC 3139599 . PMID 21818304 .   Servidor ENZO

Otras lecturas

Introductorio

• Cornish-Bowden, Athel (2012). Fundamentos de la cinética enzimática (4ª ed.). Weinheim: Wiley-Blackwell. ISBN 978-3-527-33074-4.
• Stevens L., Price NC (1999). Fundamentos de la enzimología: la biología celular y molecular de las proteínas catalíticas . Oxford [Oxfordshire]: Oxford University Press. ISBN 978-0-19-850229-6.
• Bugg, Tim (2004). Introducción a la Química de Enzimas y Coenzimas . Cambridge, MA: Blackwell Publishers. ISBN 978-1-4051-1452-3.
• Segel, Irwin H. (1993). Cinética enzimática: comportamiento y análisis de sistemas enzimáticos de equilibrio rápido y estado estacionario . Nueva York: Wiley. ISBN 978-0-471-30309-1.

Avanzado

• Fersht, Alan (1999). Estructura y mecanismo en la ciencia de las proteínas: una guía para la catálisis enzimática y el plegamiento de proteínas . San Francisco: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-3268-6.
• Schnell S, Maini PK (2004). "Un siglo de cinética enzimática: fiabilidad de las estimaciones de K M y v max " . Comentarios sobre biología teórica . 8 (2–3): 169–87. CiteSeerX  10.1.1.493.7178 . doi : 10.1080 / 08948550302453 . Consultado el 22 de septiembre de 2020 .
• Walsh, Christopher (1979). Mecanismos de reacción enzimática . San Francisco: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-0070-8.
• Cleland WW, Cook P (2007). Cinética y mecanismo enzimático . Nueva York: Garland Science. ISBN 978-0-8153-4140-6.

enlaces externos

• Animación de un ensayo enzimático : muestra los efectos de la manipulación de las condiciones del ensayo.
• MACiE : una base de datos de mecanismos de reacción enzimática
• ENZIMA base de datos de nomenclatura de enzimas Expasy -
• ENZO - Aplicación web para una construcción sencilla y pruebas rápidas de modelos cinéticos de reacciones catalizadas por enzimas.
• ExCatDB : una base de datos de mecanismos catalíticos enzimáticos
• BRENDA - Base de datos completa de enzimas, que ofrece sustratos, inhibidores y diagramas de reacción.
• SABIO-RK : una base de datos de cinética de reacciones
• Grupo de investigación de Joseph Kraut, Universidad de California en San Diego - Animaciones de varios mecanismos de reacción enzimática
• Simbolismo y terminología en cinética enzimática : una explicación completa de conceptos y terminología en cinética enzimática
• Una introducción a la cinética de las enzimas : un conjunto accesible de tutoriales en línea sobre la cinética de las enzimas
• Tutorial animado de cinética enzimática: tutorial animado con audio