La electroforesis de flujo libre (FFE) , también conocida como electroforesis sin portadores , es una técnica de separación electroforética sin matriz . La FFE es una técnica análoga a la electroforesis capilar , con una resolución comparable, que se puede utilizar para cuestiones científicas, donde se necesitan cantidades de muestras semipreparativas y preparativas. Se utiliza para separar muestras cuantitativamente según diferencias de carga o punto isoeléctrico. Debido a la versatilidad de la técnica, una amplia gama de protocolos para la separación de muestras como iones de metales raros , isoformas de proteínas , complejos multiproteicos , péptidos , orgánulos ,Existen células , origami de ADN , suero sanguíneo y nanopartículas . La ventaja de FFE es la separación rápida y suave de las muestras disueltas en un solvente líquido sin necesidad de matriz, como la poliacrilamida en electroforesis en gel . Esto asegura una tasa de recuperación muy alta ya que los analitos no se adhieren a ningún portador o estructura de matriz. Debido a su naturaleza continua y alto rendimiento de volumen, esta técnica permite una separación rápida de cantidades preparativas de muestras con una resolución muy alta. Además, las separaciones se pueden realizar en condiciones nativas o desnaturalizantes. [1]
Historia
FFE fue desarrollado en la década de 1960 por Kurt Hannig en el Instituto Max-Planck en Alemania. [2] Hasta la década de 1980, era una tecnología estandarizada para la separación de células y orgánulos , y el FFE incluso se probó en el espacio para minimizar la sedimentación bajo gravedad cero . [3] A medida que la citometría de flujo se convirtió en el método estándar para la clasificación de células, los desarrollos de FFE se centraron en la separación de proteínas y partículas cargadas. Algunos grupos también están trabajando en versiones miniaturizadas de sistemas FFE o micro FFE. [4]
Técnica
La cámara de separación consta de una placa posterior y una placa frontal. La placa posterior generalmente consiste en un bloque de aluminio enfriado, cubierto con un espejo de vidrio cubierto de plástico. La placa frontal hoy en día está hecha de PMMA , en épocas anteriores se utilizaba vidrio. La distancia entre la placa frontal y la trasera se puede ajustar mediante espaciadores y suele estar entre 0,1 y 0,5 mm. La placa frontal también contiene las entradas para los tampones de separación y la muestra, las salidas para los tubos de fraccionamiento y los alambres de platino como electrodos. Al aplicar diferentes tampones sobre las múltiples entradas de tampón, el operador puede cambiar el pH, las concentraciones de sal o la composición y, por lo tanto, las condiciones de separación en el ancho de la cámara. Los tampones de separación y la muestra se aplican mediante bombas peristálticas , para asegurar un flujo laminar . Se aplica un campo eléctrico de alto voltaje perpendicular al flujo laminar. Los analitos en el flujo laminar se pueden separar por densidad de carga y / o punto isoeléctrico . Debido a su naturaleza altamente versátil, esta técnica puede hacer uso de diferentes modos de electroforesis, como por ejemplo isotacoforesis, enfoque isoeléctrico o electroforesis de zona (intervalo).
Al final de la celda de separación, la muestra separada se divide en los tubos de fraccionamiento y se recoge en placas de microtitulación. [5]
Posteriormente, las muestras se pueden caracterizar mediante todas las técnicas principales como HPLC , LC-MS , espectrometría de masas ( ESI / MALDI , según el protocolo utilizado) o electroforesis (IEF / SDS PAGE , 2D-PAGE ).
Aplicaciones
La aplicación estándar incluye la separación de alta resolución de complejos de proteínas, proteínas de membrana, isoformas de proteínas y anticuerpos, células, compartimentos subcelulares (como orgánulos, ribosomas) y liposomas. [6] Haciendo uso de gradientes de pH muy planos, generados por anfolitos , es posible separar isoformas de proteínas, que varían en menos de 0.02 unidades de pH, con un rendimiento de alrededor de 3 mg / h. [7] También es posible agregar aditivos a los tampones, para aumentar la resolución o desnaturalizar las muestras. Típicamente concentraciones de urea hasta 8M, 0.1-1% de detergentes como: CHAPS, CHAPSO, Digitonin, Dodecil-ß-D-maltósido, Octil-ß-D-glucósido, Triton-X-114 (IEF) y DTT hasta Se toleran 50 mM.
Caracteristicas clave
- Separación sin matriz, ideal para conservar la actividad proteica / complejos proteicos
- Separación de alta resolución de complejos de proteínas, proteínas de membrana, isoformas de proteínas, células, compartimentos subcelulares (como orgánulos, ribosomas, etc.),
- Rango de tamaño de separación desde iones hasta células completas
- Recuperación de muestras de hasta el 99%, según la muestra y el modo de funcionamiento
- Alta reproducibilidad de corridas individuales
- Separación en varios minutos
- Protocolos para la separación de enfoque isoeléctrico con diferentes anfolitos comerciales y ProLytesTM atóxicos de moléculas pequeñas para aplicación clínica directa
- Detección rápida y sensible de la calidad de la separación mediante geles IEF y UV
- Compatible con muchas otras técnicas posteriores, por ejemplo, HPLC, MS, SDS-, IEF- y 2D-GE
- Adecuado para la separación de proteínas inestables debido al enfriamiento de muestras y la cámara de separación hasta 4 ° C
- Reducción de la complejidad del proteoma antes de un análisis proteómico adicional [8]
- Enriquecimiento de proteínas poco abundantes al eliminar el exceso de proteínas no deseadas.
- Compatible con volúmenes de muestra grandes y pequeños desde alrededor de 50 µL hasta varios mililitros.
- Modos de operación preparativos y analíticos
- Admite todos los modos de separación electroforética (IEF, IZE, ZE, ITP)
- Se puede ejecutar en condiciones nativas o desnaturalizantes.
Referencias
- ^ PD Patel y G. Weber, Electroforesis en fluido libre: una revisión de la tecnología y aplicaciones agroalimentarias, J. Biol. Phys. Chem. 2003, 3, 60–73.
- ^ Electroforesis de flujo libre, Kurt Hannig y Hans G. Heidrich, GIT Verlag 1990, ISBN 3-921956-88-9
- ^ Electroforesis en el espacio - 1985, PDF
- ^ S. Jezierski, L. Gitlin, S. Nagl, D. Belder, Litografía en fase líquida de varios pasos para la creación rápida de prototipos de chips de electroforesis de flujo libre de microfluidos, Anal. Bioanal. Chem., 2011, 401, 2651-2656.
- ^ "Principio de las separaciones FFE" . Archivado desde el original el 1 de diciembre de 2014 . Consultado el 4 de junio de 2013 .
- ^ Aplicaciones de la electroforesis de flujo libre
- ^ [1]
- ^ Islinger, M; Eckerskorn, C; Völkl, A (2010). "Electroforesis de flujo libre en la era proteómica: una técnica en flujo". Electroforesis . 31 : 1754–63. doi : 10.1002 / elps.200900771 . PMID 20506416 .
enlaces externos
- Descripción de la electroforesis de flujo libre de la Sociedad Americana de Electroforesis
- Descripción de la patente del método de electroforesis de flujo libre