El fragmento de Klenow es un gran fragmento de proteína producido cuando la ADN polimerasa I de E. coli es escindida enzimáticamente por la proteasa subtilisina . Reportado por primera vez en 1970, [1] retiene la actividad polimerasa 5 '→ 3' y la actividad exonucleasa 3 '→ 5' para la eliminación de nucleótidos precodificadores y corrección de pruebas, pero pierde su actividad exonucleasa 5 '→ 3'.
El otro fragmento más pequeño formado cuando la ADN polimerasa I de E. coli es escindida por subtilisina retiene la actividad exonucleasa 5 '→ 3' pero no tiene las otras dos actividades exhibidas por el fragmento Klenow (es decir, actividad polimerasa 5 '→ 3', y Actividad exonucleasa 3 '→ 5').
Investigar
Debido a que la actividad exonucleasa 5 '→ 3' de la ADN polimerasa I de E. coli la hace inadecuada para muchas aplicaciones, el fragmento de Klenow, que carece de esta actividad, puede ser muy útil en la investigación. El fragmento de Klenow es extremadamente útil para tareas basadas en investigación como:
- Síntesis de ADN bicatenario a partir de moldes monocatenarios
- Relleno de los extremos 3 'retrocedidos de los fragmentos de ADN para hacer que el saliente 5' sea romo
- Digerir los voladizos que sobresalen de 3 '
- Preparación de sondas de ADN radiactivo
El fragmento de Klenow también fue la enzima original utilizada para amplificar en gran medida segmentos de ADN en el proceso de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), [2] antes de ser reemplazado por enzimas termoestables como la polimerasa Taq . [3]
El exo- fragmento de Klenow
Así como la actividad exonucleasa 5 '→ 3' de la ADN polimerasa I de E. coli puede ser indeseable, la actividad exonucleasa 3 '→ 5' del fragmento Klenow también puede ser indeseable para ciertas aplicaciones. Este problema puede superarse introduciendo mutaciones en el gen que codifica Klenow. Esto da como resultado formas de la enzima que se expresan que retienen la actividad polimerasa 5 '→ 3', pero carecen de actividad exonucleasa (5 '→ 3' o 3 '→ 5'). Esta forma de la enzima se llama exo-fragmento de Klenow .
El fragmento exo-Klenow se usa en algunas reacciones de marcaje fluorescente para microarrays, y también en colas dA y dT, un paso importante en el proceso de ligar adaptadores de ADN a fragmentos de ADN, que se usa con frecuencia en la preparación de bibliotecas de ADN para la secuenciación de próxima generación. (por ejemplo, ver [1] )
Referencias
- ^ Klenow H y Henningsen I (1970). "Eliminación selectiva de la actividad exonucleasa de la polimerasa del ácido desoxirribonucleico de Escherichia coli B por proteólisis limitada" . Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 65 (1): 168-175. doi : 10.1073 / pnas.65.1.168 . PMC 286206 . PMID 4905667 .
- ^ Saiki RK y col. (1985). "Amplificación enzimática de secuencias genómicas de β-globina y análisis de sitios de restricción para el diagnóstico de anemia de células falciformes". Ciencia . 230 : 1350–54. doi : 10.1126 / science.2999980 . PMID 2999980 .
- ^ Saiki; et al. (1988). "Amplificación enzimática de ADN dirigida por cebadores con una ADN polimerasa termoestable". Ciencia . 239 : 487–91. doi : 10.1126 / science.239.4839.487 . PMID 2448875 .
enlaces externos
- Klenow + Fragment en los encabezados de temas médicos (MeSH) de la Biblioteca Nacional de Medicina de EE. UU .
- Diagrama en vivo.colostate.edu