El ensayo MTT es un ensayo colorimétrico para evaluar la actividad metabólica celular. [1] Las enzimas oxidorreductasa celulares dependientes de NAD (P) H pueden, en condiciones definidas, reflejar el número de células viables presentes. Estas enzimas son capaces de reducir el tinte de tetrazolio MTT 3- (4,5- di metil tiazol -2-il) -2,5-di fenil tetrazolio bromuro a su formazan insoluble, que tiene un color violeta. Otros colorantes de tetrazolio estrechamente relacionados, incluidos XTT, MTS y WST, se utilizan junto con el aceptor de electrones intermedio, metosulfato de 1-metoxifenazina (PMS). Con WST-1, que es impermeable a las células, la reducción se produce fuera de la célula a través del transporte de electrones de la membrana plasmática. [2] Sin embargo, esta explicación tradicionalmente asumida se sostiene actualmente como prueba también se ha encontrado de la reducción de MTT a formazán en estructuras celulares lipídicas sin participación aparente de oxidorreductasas. [3]
Los ensayos de colorante de tetrazolio también se pueden usar para medir la citotoxicidad (pérdida de células viables) o la actividad citostática (cambio de proliferación a quiescencia) de posibles agentes medicinales y materiales tóxicos. Los ensayos de MTT generalmente se realizan en la oscuridad ya que el reactivo de MTT es sensible a la luz.
El MTT , un tetrazol amarillo , se reduce a formazán púrpura en las células vivas. [4] Se agrega una solución de solubilización (generalmente dimetilsulfóxido , una solución de etanol acidificada o una solución del detergente dodecilsulfato de sodio en ácido clorhídrico diluido ) para disolver el producto de formazán púrpura insoluble en una solución coloreada. La absorbancia de esta solución coloreada se puede cuantificar midiendo a una cierta longitud de onda (generalmente entre 500 y 600 nm) con un espectrofotómetro . El grado de absorción de luz depende del grado de concentración de formazán acumulado dentro de la célula y en la superficie celular. Cuanto mayor sea la concentración de formazán, más intenso será el color púrpura y, por tanto, mayor será la absorbancia.
Se ha propuesto que XTT (2,3-bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -2H-tetrazolio-5-carboxanilida) reemplace al MTT, lo que produce una mayor sensibilidad y un rango dinámico más alto. El tinte formazán formado es soluble en agua, evitando un paso de solubilización final. [5]
Las sales de tetrazolio solubles en agua son alternativas más recientes al MTT: se desarrollaron mediante la introducción de cargas positivas o negativas y grupos hidroxi en el anillo de fenilo de la sal de tetrazolio, o mejor con grupos sulfonato añadidos directa o indirectamente al anillo de fenilo.
MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazolio), en presencia de metosulfato de fenazina ( PMS ), produce un formazán producto que tiene un máximo de absorbancia a 490 nm en solución salina tamponada con fosfato. El ensayo MTS se describe a menudo como un ensayo MTT de "un solo paso", que ofrece la conveniencia de agregar el reactivo directamente al cultivo celular sin los pasos intermitentes requeridos en el ensayo MTT. Sin embargo, esta conveniencia hace que el ensayo MTS sea susceptible a la interferencia colorimétrica, ya que los pasos intermitentes en el ensayo MTT eliminan los rastros de compuestos coloreados, mientras que estos permanecen en la placa de microtitulación en el ensayo MTS de un solo paso. Se necesitan precauciones para garantizar la precisión al utilizar este ensayo y existen argumentos sólidos para confirmar los resultados de MTS mediante observaciones cualitativas bajo un microscopio. (Esto, sin embargo, es prudente para todos los ensayos colorimétricos). [6]
Las WST (sales de tetrazolio solubles en agua) son una serie de otros colorantes solubles en agua para ensayos MTT, desarrollados para dar diferentes espectros de absorción de los formazanos formados. [7] WST-1 y en particular WST-8 (2- (2-metoxi-4-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-disulfofenil) -2H-tetrazolio), son ventajosos. sobre MTT en el sentido de que se reducen fuera de las células, se combinan con el mediador de electrones PMS y producen un formazán soluble en agua. Finalmente, los ensayos de WST (1) se pueden leer directamente (a diferencia del MTT que necesita un paso de solubilización), (2) dan una señal más eficaz que el MTT y (3) disminuyen la toxicidad para las células (a diferencia del MTT permeable a las células y su insoluble formazan que se acumulan dentro de las células). [7]
Importancia del ensayo MTT
En general, se supone que la reducción del colorante de tetrazolio depende de las enzimas oxidorreductasa dependientes de NAD (P) H en gran parte en el compartimento citosólico de la célula. [2] [8] Por lo tanto, la reducción de MTT y otros colorantes de tetrazolio depende de la actividad metabólica celular debido al flujo de NAD (P) H. Las células con un metabolismo bajo, como los timocitos y los esplenocitos, reducen muy poco el MTT. En contraste, las células que se dividen rápidamente exhiben altas tasas de reducción de MTT. Es importante tener en cuenta que las condiciones del ensayo pueden alterar la actividad metabólica y, por tanto, la reducción del tinte de tetrazolio sin afectar la viabilidad celular. Además, el mecanismo de reducción de los colorantes de tetrazolio, es decir , intracelular (MTT, MTS) frente a extracelular (WST-1), también determinará la cantidad de producto. Además, se han proporcionado pruebas de la reducción espontánea de MTT en los compartimentos / estructuras celulares lipídicos, sin catálisis enzimática involucrada. [3] Sin embargo, incluso bajo este paradigma alternativo, el ensayo MTT todavía evalúa el potencial de reducción de una célula (es decir, la disponibilidad de compuestos reductores para impulsar la energía celular). [1] Como tal, la interpretación de la viabilidad celular final permanece sin cambios.
Ver también
Referencias
- ↑ a b Stockert JC, Horobin RW, Colombo LL, Blázquez-Castro A (abril de 2018). "Sales de tetrazolio y productos de formazán en biología celular: evaluación de la viabilidad, imágenes de fluorescencia y perspectivas de etiquetado" (PDF) . Acta Histochemica . 120 (3): 159-167. doi : 10.1016 / j.acthis.2018.02.005 . PMID 29496266 .
- ^ a b Berridge MV, Herst PM, Tan AS (2005). "Tintes de tetrazolio como herramientas en biología celular: nuevos conocimientos sobre su reducción celular". Revisión anual de biotecnología . 11 : 127–52. doi : 10.1016 / S1387-2656 (05) 11004-7 . ISBN 9780444519528. PMID 16216776 .
- ^ a b Stockert JC, Blázquez-Castro A, Cañete M, Horobin RW, Villanueva A (diciembre de 2012). "Ensayo MTT para la viabilidad celular: localización intracelular del producto formazán en gotitas de lípidos". Acta Histochemica . 114 (8): 785–96. doi : 10.1016 / j.acthis.2012.01.006 . PMID 22341561 .
- ^ Mosmann T (diciembre de 1983). "Ensayo colorimétrico rápido de crecimiento y supervivencia celular: aplicación a ensayos de proliferación y citotoxicidad". Revista de métodos inmunológicos . 65 (1–2): 55–63. doi : 10.1016 / 0022-1759 (83) 90303-4 . PMID 6606682 .
- ^ "¿Por qué debería utilizar XTT en lugar de MTT" (PDF, 0,1 MB) . [aniara.com] . ANIARA . Consultado el 19 de noviembre de 2010 .
- ^ Cory AH, Owen TC, Barltrop JA, Cory JG (julio de 1991). "Uso de un ensayo de tetrazolio / formazán soluble en agua para ensayos de crecimiento celular en cultivo". Comunicaciones sobre el cáncer . 3 (7): 207–12. doi : 10.3727 / 095535491820873191 . PMID 1867954 .
- ^ a b "Sales de tetrazolio solubles en agua (WST)" (PDF, 0,4 MB) . [interchim.com] . Interchim . Consultado el 12 de agosto de 2013 .
- ^ Berridge MV, Tan AS (junio de 1993). "Caracterización de la reducción celular de bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT): localización subcelular, dependencia del sustrato y participación del transporte de electrones mitocondriales en la reducción de MTT". Archivos de Bioquímica y Biofísica . 303 (2): 474–82. doi : 10.1006 / abbi.1993.1311 . PMID 8390225 .
Otras lecturas
- Wilson AP (2000). "Capítulo 7: Citotoxicidad y viabilidad". En Masters JR (ed.). Cultivo de células animales: un enfoque práctico . 1 (3ª ed.). Oxford: Prensa de la Universidad de Oxford . ISBN 978-0-19-963796-6. LCCN 00026267 . OCLC 43555390 .
- Bernas T, Dobrucki J (abril de 2002). "Reducción mitocondrial y no mitocondrial de MTT: interacción de MTT con sondas fluorescentes mitocondriales TMRE, JC-1 y NAO" . Citometría . 47 (4): 236–42. doi : 10.1002 / cyto.10080 . PMID 11933013 .
enlaces externos
- Protocolo de ensayo MTT