Las pinzas magnéticas (MT) son instrumentos científicos para la manipulación y caracterización de biomoléculas o polímeros. Estos aparatos ejercen fuerzas y momentos de torsión sobre moléculas individuales o grupos de moléculas. Se puede utilizar para medir la resistencia a la tracción o la fuerza generada por las moléculas.
La mayoría de las veces, las pinzas magnéticas se utilizan para estudiar las propiedades mecánicas de macromoléculas biológicas como el ADN o las proteínas en experimentos de una sola molécula . Otras aplicaciones son la reología de la materia blanda y los estudios de procesos regulados por fuerza en células vivas. Las fuerzas son típicamente del orden de pico a nanonewtons. Debido a su arquitectura simple, las pinzas magnéticas son una herramienta biofísica popular .
En los experimentos, la molécula de interés se une a una micropartícula magnética. La pinza magnética está equipada con imanes que se utilizan para manipular las partículas magnéticas cuya posición se mide con la ayuda de microscopía de video.
Principio de construcción y física de las pinzas magnéticas.
Un aparato de pinzas magnéticas consta de micropartículas magnéticas, que pueden manipularse con la ayuda de un campo magnético externo. Luego, la posición de las partículas magnéticas se determina mediante un objetivo microscópico con una cámara.
![Molecule attached to a tethering surface and a magnetic bead. The bead is placed in a magnetic field gradient that exerts a force on the bead.](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/8/86/Magnetic_tweezers.svg/220px-Magnetic_tweezers.svg.png)
Partículas magnéticas
Las partículas magnéticas para la operación en pinzas magnéticas vienen con una amplia gama de propiedades y deben elegirse de acuerdo con la aplicación prevista. En los siguientes párrafos se describen dos tipos básicos de partículas magnéticas; sin embargo, también existen otras como las nanopartículas magnéticas en ferrofluidos , que permiten experimentos dentro de una célula.
- Cuentas superparamagnéticas
Las perlas superparamagnéticas están disponibles comercialmente con varias características diferentes. El más común es el uso de partículas esféricas de un diámetro en el rango de micrómetros. Consisten en una matriz de látex porosa en la que se han incrustado nanopartículas magnéticas. El látex es autofluorescente y, por tanto, puede resultar ventajoso para la formación de imágenes de su posición. Las partículas de forma irregular presentan una mayor superficie y, por tanto, una mayor probabilidad de unirse a las moléculas a estudiar. [1] El recubrimiento de las microperlas también puede contener ligandos capaces de unir las moléculas de interés. Por ejemplo, el recubrimiento puede contener estreptavidina que se acopla fuertemente a biotina , que a su vez puede estar unida a las moléculas de interés.
Cuando se exponen a un campo magnético externo, estas microperlas se magnetizan. El momento magnético inducido es proporcional a un campo magnético externo débil :
dónde es la permeabilidad al vacío . También es proporcional al volumende las microesferas , que se debe al hecho de que el número de nanopartículas magnéticas aumenta con el tamaño de la perla. La susceptibilidad magnética se supone que es escalar en esta primera estimación y puede ser calculado por , dónde es la permeabilidad relativa . En un campo externo fuerte, el momento magnético inducido se satura a un valor dependiente del material. La fuerza experimentado por una microperla se puede derivar del potencial de este momento magnético en un campo magnético exterior: [2]
El campo magnético exterior se puede evaluar numéricamente con la ayuda del análisis de elementos finitos o simplemente midiendo el campo magnético con la ayuda de un sensor de efecto Hall . Teóricamente sería posible calcular la fuerza sobre las perlas con estas fórmulas; sin embargo, los resultados no son muy confiables debido a las incertidumbres de las variables involucradas, pero permiten estimar el orden de magnitud y ayudan a comprender mejor el sistema. Se pueden obtener valores numéricos más precisos considerando el movimiento browniano de las perlas.
Debido a las anisotropías en la distribución estocástica de las nanopartículas dentro de la microperla, el momento magnético no está perfectamente alineado con el campo magnético externo, es decir, el tensor de susceptibilidad magnética no se puede reducir a un escalar. Por esta razón, las perlas también están sometidas a un par de torsión.que intenta alinear y :
Los pares generados por este método suelen ser mucho mayores que , que es más que necesario para torcer las moléculas de interés. [3]
- Nanocables ferromagnéticos
El uso de nanocables ferromagnéticos para el funcionamiento de pinzas magnéticas amplía su campo de aplicación experimental. La longitud de estos cables suele ser del orden de decenas de nanómetros hasta decenas de micrómetros, que es mucho mayor que su diámetro. En comparación con las perlas superparamagnéticas, permiten la aplicación de fuerzas y momentos de torsión mucho mayores. Además de eso, presentan un momento magnético remanente. Esto permite la operación en intensidades de campo magnético débiles. Es posible producir nanocables con segmentos superficiales que presentan diferentes propiedades químicas, lo que permite controlar la posición donde las moléculas estudiadas pueden unirse al cable. [1]
Imanes
Para poder ejercer pares sobre las microperlas son necesarios al menos dos imanes, pero se han realizado muchas otras configuraciones, llegando desde un solo imán que solo tira de las microperlas magnéticas hasta un sistema de seis electroimanes que permite controlar completamente la posición tridimensional y rotación a través de un circuito de retroalimentación digital . [4] La intensidad del campo magnético disminuye aproximadamente exponencialmente con la distancia desde el eje que une los dos imanes en una escala típica de aproximadamente el ancho del espacio entre los imanes. Dado que esta escala es bastante grande en comparación con las distancias, cuando la microperla se mueve en un experimento, la fuerza que actúa sobre ella puede tratarse como constante. Por lo tanto, las pinzas magnéticas son abrazaderas de fuerza pasiva debido a la naturaleza de su construcción en contraste con las pinzas ópticas, aunque también pueden usarse como abrazaderas positivas cuando se combinan con un bucle de retroalimentación. La intensidad del campo puede aumentarse afilando la cara polar del imán, lo que, sin embargo, también disminuye el área donde el campo puede considerarse constante. Una conexión de anillo de hierro con los polos exteriores de los imanes puede ayudar a reducir los campos perdidos. Las pinzas magnéticas se pueden operar tanto con imanes permanentes como con electroimanes. Las dos técnicas tienen sus ventajas específicas. [3]
- Magnetos permanentes
Los imanes permanentes de las pinzas magnéticas suelen estar fabricados con materiales de tierras raras, como el neodimio, y pueden alcanzar intensidades de campo superiores a 1,3 Tesla. [5] La fuerza sobre las perlas puede controlarse moviendo los imanes a lo largo del eje vertical. Moverlos hacia arriba disminuye la intensidad del campo en la posición de la cuenta y viceversa. Los pares de torsión en las perlas magnéticas se pueden ejercer girando los imanes alrededor del eje vertical para cambiar la dirección del campo. El tamaño de los imanes es del orden de milímetros, así como su espaciado. [3]
- Electroimanes
El uso de electroimanes en pinzas magnéticas tiene la ventaja de que la intensidad y la dirección del campo se pueden cambiar simplemente ajustando la amplitud y la fase de la corriente de los imanes. Por este motivo, no es necesario mover los imanes, lo que permite un control más rápido del sistema y reduce el ruido mecánico. Para aumentar la intensidad de campo máxima, se puede agregar al solenoide un núcleo de un material paramagnético blando con alta saturación y baja remanencia . En cualquier caso, sin embargo, las intensidades de campo típicas son mucho menores en comparación con las de los imanes permanentes de tamaño comparable. Además, el uso de electroimanes requiere altas corrientes que producen calor que puede requerir un sistema de enfriamiento. [1]
Sistema de seguimiento de cuentas
El desplazamiento de las perlas magnéticas corresponde a la respuesta del sistema al campo magnético impuesto y, por lo tanto, debe medirse con precisión: en una configuración típica, el volumen experimental se ilumina desde la parte superior para que las perlas produzcan anillos de difracción en el plano focal de un objetivo que se coloca debajo de la superficie de sujeción. El patrón de difracción es luego registrado por una cámara CCD . La imagen puede ser analizada en tiempo real por una computadora. La detección de la posición en el plano de la superficie de anclaje no es complicada ya que corresponde al centro de los anillos de difracción. La precisión puede alcanzar unos pocos nanómetros. Para la posición a lo largo del eje vertical, el patrón de difracción debe compararse con las imágenes de referencia, que muestran el patrón de difracción de la perla considerada en una serie de distancias conocidas desde el plano focal. Estas imágenes de calibración se obtienen manteniendo un cordón fijo mientras se desplaza el objetivo, es decir, el plano focal, con la ayuda de elementos piezoeléctricos a distancias conocidas. Con la ayuda de la interpolación, la resolución puede alcanzar una precisión de hasta 10 nm a lo largo de este eje. [6] Las coordenadas obtenidas se pueden utilizar como entrada para un bucle de retroalimentación digital que controla la intensidad del campo magnético, por ejemplo, para mantener la cuenta en una posición determinada.
Por lo general, también se añaden perlas no magnéticas a la muestra como referencia para proporcionar un vector de desplazamiento de fondo. Tienen un diámetro diferente al de las perlas magnéticas, por lo que son ópticamente distinguibles. Esto es necesario para detectar la posible deriva del fluido. Por ejemplo, si la densidad de las partículas magnéticas es demasiado alta, pueden arrastrar consigo el fluido viscoso circundante. El vector de desplazamiento de una cuenta magnética se puede determinar restando su vector de posición inicial y este vector de desplazamiento de fondo de su posición actual.
Forzar calibración
La determinación de la fuerza que ejerce el campo magnético sobre las perlas magnéticas se puede calcular considerando las fluctuaciones térmicas de la perla en el plano horizontal: El problema es simétrico rotacional con respecto al eje vertical; de aquí en adelante, una dirección elegida arbitrariamente en el plano de simetría se llama. El análisis es el mismo para la dirección ortogonal a la dirección x y puede usarse para aumentar la precisión. Si el cordón deja su posición de equilibrio en el-eje por debido a las fluctuaciones térmicas, será sometido a una fuerza de restauración que aumenta linealmente con en la aproximación de primer orden. Considerando solo los valores absolutos de los vectores involucrados, es geométricamente claro que la constante de proporcionalidad es la fuerza ejercida por los imanes. sobre la longitud de la molécula que mantiene el cordón anclado a la superficie de sujeción:
![Magnetic bead anchored to a surface by a molecule of length l. It is pulled up by a force F and if deviated horizontally by thermal fluctuations by delta x an additional restoring force F_r acts on the bead.](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/4/4d/Magnetic_tweezers2.svg/220px-Magnetic_tweezers2.svg.png)
.
El teorema de equipartición establece que la energía media que se almacena en este "resorte" es igual apor grado de libertad. Dado que aquí solo se considera una dirección, la energía potencial del sistema dice:. A partir de esto, se puede deducir una primera estimación de la fuerza que actúa sobre la cuenta:
.
Sin embargo, para una calibración más precisa, es necesario un análisis en el espacio de Fourier. La densidad del espectro de potencia de la posición de la perla está disponible experimentalmente. A continuación se deriva una expresión teórica de este espectro, que luego se puede ajustar a la curva experimental para obtener la fuerza ejercida por los imanes sobre la perla como parámetro de ajuste. Por definición, este espectro es el módulo al cuadrado de la transformada de Fourier de la posición sobre el ancho de banda espectral :
se puede obtener considerando la ecuación de movimiento para una perla de masa :
El termino corresponde a la fuerza de fricción de Stokes para una partícula esférica de radio en un medio de viscosidad y es la fuerza restauradora que se opone a la fuerza estocástica debido al movimiento browniano. Aquí, uno puede descuidar el término inercial, porque el sistema está en un régimen de número de Reynolds muy bajo . [1]
La ecuación de movimiento puede ser transformada de Fourier insertando la fuerza motriz y la posición en el espacio de Fourier:
Esto lleva a:
.
La densidad espectral de potencia de la fuerza estocástica. se puede derivar utilizando el teorema de equipartición y el hecho de que las colisiones brownianas no están correlacionadas en absoluto: [7]
Esto corresponde al teorema de fluctuación-disipación . Con esa expresión, es posible dar una expresión teórica para el espectro de potencia:
El único desconocido en esta expresión, , se puede determinar ajustando esta expresión al espectro de potencia experimental. Para obtener resultados más precisos, se puede restar el efecto debido al tiempo finito de integración de la cámara del espectro experimental antes de realizar el ajuste. [6]
Otro método de calibración de fuerza es utilizar el arrastre viscoso de las microperlas: por lo tanto, las microperlas se arrastran a través del medio viscoso mientras se registra su posición. Dado que el número de Reynolds para el sistema es muy bajo, es posible aplicar la ley de Stokes para calcular la fuerza de fricción que está en equilibrio con la fuerza ejercida por los imanes:
.
La velocidad se puede determinar utilizando los valores de velocidad registrados. La fuerza obtenida a través de esta fórmula se puede relacionar con una configuración dada de los imanes, que puede servir como calibración. [8]
Configuración experimental típica
![Three schematic torsion-extension curves of a DNA molecule at different stretching forces. For the lowest force, the extension shrinks for both, positive and negative torsion and the curve is symmetric for the positive and negative torsion branch. For intermediate forces, the extension diminishes only for positive turns and for the highest forces it stays constant. The number of turns is in the order of hundreds, and the extension is typically in the order of micrometers.](http://wikiimg.tojsiabtv.com/wikipedia/commons/thumb/8/88/DNA_twist_simple.svg/220px-DNA_twist_simple.svg.png)
Esta sección da un ejemplo de un experimento realizado por Strick, Allemand, Croquette [9] con la ayuda de pinzas magnéticas. Una molécula de ADN de doble hebra se fija con múltiples sitios de unión en un extremo a una superficie de vidrio y en el otro a una microperla magnética, que se puede manipular en un aparato de pinzas magnéticas. Al girar los imanes, se puede aplicar tensión de torsión a la molécula de ADN. Las rotaciones en el sentido de la hélice de ADN se cuentan positivamente y viceversa. Mientras se retuerce, las pinzas magnéticas también permiten estirar la molécula de ADN. De esta manera, las curvas de extensión de torsión se pueden registrar con diferentes fuerzas de estiramiento. Para fuerzas bajas (menos de aproximadamente 0,5 pN), el ADN forma superenrollamientos, los llamados plectonemas, que disminuyen la extensión de la molécula de ADN de forma bastante simétrica para giros positivos y negativos. El aumento de la fuerza de tracción ya aumenta la extensión para una torsión impuesta cero. Los giros positivos conducen nuevamente a la formación de plectonemas que reducen la extensión. Sin embargo, el giro negativo no cambia mucho la extensión de la molécula de ADN. Esto se puede interpretar como la separación de las dos cadenas que corresponde a la desnaturalización de la molécula. En el régimen de fuerza alta, la extensión es casi independiente de la tensión de torsión aplicada. La interpretación es la aparición de regiones locales de ADN altamente enrollado. Un parámetro importante de este experimento es también la fuerza iónica de la solución que afecta los valores críticos de la fuerza de tracción aplicada que separa los tres regímenes de fuerza. [9]
Historia y desarrollo
Aplicar la teoría magnética al estudio de la biología es una técnica biofísica que comenzó a aparecer en Alemania a principios de la década de 1920. Posiblemente la primera demostración fue publicada por Alfred Heilbronn en 1922; su trabajo analizó la viscosidad de los protoplastos . [10] Al año siguiente, Freundlich y Seifriz exploraron la reología en huevos de equinodermo . Ambos estudios incluyeron la inserción de partículas magnéticas en las células y las observaciones de movimiento resultantes en un gradiente de campo magnético . [11]
En 1949 en la Universidad de Cambridge, Francis Crick y Arthur Hughes demostraron un uso novedoso de la técnica, llamándola "El método de partículas magnéticas". La idea, que originalmente vino del Dr. Honor Fell , era que pequeñas perlas magnéticas, fagocitadas por células enteras cultivadas en cultivo, podían ser manipuladas por un campo magnético externo. Se permitió que el cultivo de tejidos creciera en presencia del material magnético, y las células que contenían una partícula magnética podían verse con un microscopio de alta potencia. A medida que la partícula magnética se movía a través de la célula por un campo magnético, se realizaron mediciones sobre las propiedades físicas del citoplasma . [12] Aunque algunos de sus métodos y mediciones eran, sin duda, toscos, su trabajo demostró la utilidad de la manipulación de partículas del campo magnético y allanó el camino para futuros desarrollos de esta técnica. El método de fagocitosis de partículas magnéticas se siguió utilizando durante muchos años para investigar la reología del citoplasma y otras propiedades físicas en células completas. [13] [14]
Una innovación en la década de 1990 condujo a una expansión de la utilidad de la técnica de una manera similar al método de pinzas ópticas emergente en ese momento . Unir químicamente una molécula de ADN individual entre una cuenta magnética y un portaobjetos de vidrio permitió a los investigadores manipular una sola molécula de ADN con un campo magnético externo. Tras la aplicación de fuerzas de torsión a la molécula, las desviaciones del movimiento de forma libre podrían medirse contra las curvas de fuerza estándar teóricas o el análisis de movimiento browniano . Esto proporcionó información sobre las propiedades estructurales y mecánicas del ADN , como la elasticidad . [15] [16]
Las pinzas magnéticas como técnica experimental se han vuelto excepcionalmente diversas en uso y aplicación. Más recientemente, se ha descubierto o propuesto la introducción de métodos aún más novedosos. Desde 2002, se ha explorado el potencial de experimentos que involucran muchas moléculas de anclaje y perlas magnéticas paralelas, arrojando luz sobre la mecánica de interacción, especialmente en el caso de proteínas de unión al ADN . [17] En 2005 se publicó una técnica que implicaba recubrir una cuenta magnética con un receptor molecular y el portaobjetos de vidrio con su ligando . Esto permite una mirada única a la fuerza de disociación receptor-ligando. [18] En 2007, Kollmannsberger y Fabry desarrollaron un nuevo método para manipular magnéticamente células completas. La técnica implica unir perlas a la matriz extracelular y manipular la célula desde el exterior de la membrana para observar la elasticidad estructural. [11] Este método sigue utilizándose como medio para estudiar la reología , así como las proteínas estructurales celulares . [19] Un estudio apareció en 2013 que usaba pinzas magnéticas para medir mecánicamente el desenrollado y rebobinado de un solo complejo neuronal SNARE atando todo el complejo entre una cuenta magnética y el portaobjetos, y luego usando la fuerza del campo magnético aplicada para tirar del complejo aparte. [20]
Aplicaciones biologicas
Reología de pinzas magnéticas
Las pinzas magnéticas se pueden utilizar para medir propiedades mecánicas como la reología , el estudio del flujo de materia y la elasticidad, en células completas. El método de fagocitosis descrito anteriormente es útil para capturar una cuenta magnética dentro de una célula. La medición del movimiento de las perlas dentro de la célula en respuesta a la manipulación del campo magnético externo proporciona información sobre el entorno físico dentro de la célula y la reología de los medios internos: viscosidad del citoplasma, rigidez de la estructura interna y facilidad del flujo de partículas. [12] [13] [14]
También se puede manipular magnéticamente una célula completa uniendo una perla magnética a la matriz extracelular mediante perlas magnéticas recubiertas de fibronectina . La fibronectina es una proteína que se unirá a las proteínas de la membrana extracelular . Esta técnica permite medir la rigidez celular y proporciona información sobre el funcionamiento de las proteínas estructurales. [11] El esquema que se muestra a la derecha muestra la configuración experimental ideada por Bonakdar y Schilling, et al. (2015) [19] para estudiar la proteína estructural plectina en células de ratón. La rigidez se midió como proporcional a la posición del cordón en respuesta a la manipulación magnética externa.
Experimentos de una sola molécula
Las pinzas magnéticas como método de una sola molécula es sin duda el uso más común en los últimos años. Mediante el método de una sola molécula, las pinzas moleculares proporcionan una mirada cercana a las propiedades físicas y mecánicas de las macromoléculas biológicas . De manera similar a otros métodos de una sola molécula, como las pinzas ópticas , este método proporciona una forma de aislar y manipular una molécula individual libre de las influencias de las moléculas circundantes. [17] Aquí, la perla magnética está unida a una superficie de sujeción por la molécula de interés. ADN o ARN pueden ser atados ya sea en forma de cadena sencilla o de doble cadena, o motivos estructurales enteras pueden ser atados, como uniones DNA Holliday , horquillas de ADN , o la totalidad de los nucleosomas y cromatina . Al actuar sobre la cuenta magnética con el campo magnético, se pueden aplicar diferentes tipos de fuerza de torsión para estudiar las interacciones intra-ADN, [21] así como las interacciones con topoisomerasas o histonas en los cromosomas . [17]
Estudios de un solo complejo
Sin embargo, las pinzas magnéticas van más allá de las capacidades de otros métodos de una sola molécula, ya que también se pueden observar interacciones entre y dentro de los complejos. Esto ha permitido avances recientes en la comprensión de las proteínas de unión al ADN , las interacciones receptor-ligando [18] y la escisión de las enzimas de restricción. [17] Una aplicación más reciente de pinzas magnéticas se observa en estudios de un solo complejo. Con la ayuda del ADN como agente de anclaje, se puede unir un complejo molecular completo entre la perla y la superficie de anclaje. Exactamente de la misma manera que al separar una horquilla de ADN aplicando una fuerza a la perla magnética, se puede separar un complejo completo y se puede medir la fuerza requerida para la disociación. [20] Esto también es similar al método de separar las interacciones receptor-ligando con pinzas magnéticas para medir la fuerza de disociación. [18]
Comparación con otras técnicas
Esta sección compara las características de las pinzas magnéticas con las de los otros métodos experimentales de una sola molécula más importantes: pinzas ópticas y microscopía de fuerza atómica . La interacción magnética es muy específica de las microperlas superparamagnéticas utilizadas. El campo magnético prácticamente no afecta a la muestra. Las pinzas ópticas tienen el problema de que el rayo láser también puede interactuar con otras partículas de la muestra biológica debido a los contrastes en el índice de refracción . Además de eso, el láser puede causar fotodaño y calentamiento de la muestra. En el caso de la microscopía de fuerza atómica, también puede ser difícil discriminar la interacción de la punta con la molécula estudiada de otras interacciones inespecíficas.
Gracias a la baja rigidez de la trampa, el rango de fuerzas accesibles con pinzas magnéticas es menor en comparación con las otras dos técnicas. La posibilidad de aplicar torque con pinzas magnéticas no es única: las pinzas ópticamente también pueden ofrecer esta característica cuando se operan con microperlas birrefringentes en combinación con un rayo láser polarizado circularmente.
Otra ventaja de las pinzas magnéticas es que es fácil realizar en paralelo muchas mediciones de una sola molécula.
Un inconveniente importante de las pinzas magnéticas es la baja resolución temporal y espacial debido a la adquisición de datos mediante video-microscopía. [3] Sin embargo, con la adición de una cámara de alta velocidad, se ha demostrado que la resolución temporal y espacial alcanza el nivel de Angstrom. [22]
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Otras lecturas
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