La electroforesis en gel es un método de separación y análisis de macromoléculas ( ADN , ARN y proteínas ) y sus fragmentos, en función de su tamaño y carga. Se utiliza en química clínica para separar proteínas por carga o tamaño (agarosa IEF, esencialmente independiente del tamaño) y en bioquímica y biología molecular para separar una población mixta de fragmentos de ADN y ARN por longitud, para estimar el tamaño de fragmentos de ADN y ARN o para separar proteínas por carga. [1]
Clasificación | Electroforesis |
---|---|
Otras tecnicas | |
Relacionados | Electroforesis capilar SDS-PAGE Electroforesis en gel bidimensional Electroforesis en gel con gradiente de temperatura |
Las moléculas de ácido nucleico se separan aplicando un campo eléctrico para mover las moléculas cargadas negativamente a través de una matriz de agarosa u otras sustancias. Las moléculas más cortas se mueven más rápido y migran más lejos que las más largas porque las moléculas más cortas migran más fácilmente a través de los poros del gel. Este fenómeno se llama tamizado. [2] Las proteínas se separan por la carga en agarosa porque los poros del gel son demasiado pequeños para tamizar proteínas. La electroforesis en gel también se puede utilizar para la separación de nanopartículas .
La electroforesis en gel utiliza un gel como medio anticonvectivo o medio de tamizado durante la electroforesis, el movimiento de una partícula cargada en una corriente eléctrica. Los geles suprimen la convección térmica provocada por la aplicación del campo eléctrico y también pueden actuar como medio de tamizado, retardando el paso de moléculas; los geles también pueden servir simplemente para mantener la separación terminada de modo que se pueda aplicar una tinción post electroforesis. [3] La electroforesis en gel de ADN generalmente se realiza con fines analíticos, a menudo después de la amplificación del ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), pero puede usarse como técnica preparativa antes de usar otros métodos como espectrometría de masas , RFLP , PCR, clonación , Secuenciación de ADN o transferencia Southern para una caracterización adicional.
Base fisica
La electroforesis es un proceso que permite la clasificación de moléculas en función del tamaño. Usando un campo eléctrico, se pueden hacer que las moléculas (como el ADN) se muevan a través de un gel hecho de agarosa o poliacrilamida . El campo eléctrico consta de una carga negativa en un extremo que empuja las moléculas a través del gel y una carga positiva en el otro extremo que empuja las moléculas a través del gel. Las moléculas que se clasifican se dispensan en un pozo en el material de gel. El gel se coloca en una cámara de electroforesis, que luego se conecta a una fuente de alimentación. Cuando se aplica el campo eléctrico, las moléculas más grandes se mueven más lentamente a través del gel mientras que las moléculas más pequeñas se mueven más rápido. Las moléculas de diferentes tamaños forman bandas distintas en el gel. [4]
El término " gel " en este caso se refiere a la matriz utilizada para contener y luego separar las moléculas diana. En la mayoría de los casos, el gel es un polímero reticulado cuya composición y porosidad se eligen en función del peso específico y la composición del objetivo a analizar. Cuando se separan proteínas o ácidos nucleicos pequeños ( ADN , ARN u oligonucleótidos ), el gel suele estar compuesto por diferentes concentraciones de acrilamida y un reticulante , lo que produce redes de malla de poliacrilamida de diferentes tamaños. Cuando se separan ácidos nucleicos más grandes (más de unos pocos cientos de bases ), la matriz preferida es agarosa purificada. En ambos casos, el gel forma una matriz sólida pero porosa. La acrilamida, a diferencia de la poliacrilamida, es una neurotoxina y debe manipularse con las precauciones de seguridad adecuadas para evitar intoxicaciones. La agarosa se compone de cadenas largas no ramificadas de carbohidratos no cargados sin enlaces cruzados que dan como resultado un gel con poros grandes que permite la separación de macromoléculas y complejos macromoleculares . [5]
La electroforesis se refiere a la fuerza electromotriz (EMF) que se utiliza para mover las moléculas a través de la matriz de gel. Al colocar las moléculas en pozos en el gel y aplicar un campo eléctrico, las moléculas se moverán a través de la matriz a diferentes velocidades, determinadas en gran medida por su masa cuando la relación carga-masa (Z) de todas las especies es uniforme. Sin embargo, cuando las cargas no son todas uniformes, el campo eléctrico generado por el procedimiento de electroforesis hará que las moléculas migren diferencialmente según la carga. Las especies con carga neta positiva migrarán hacia el cátodo que tiene carga negativa (porque es una celda electrolítica en lugar de galvánica ), mientras que las especies con carga neta negativa migrarán hacia el ánodo con carga positiva. La masa sigue siendo un factor en la velocidad con la que estas moléculas cargadas de manera no uniforme migran a través de la matriz hacia sus respectivos electrodos. [6]
Si se han cargado varias muestras en pozos adyacentes en el gel, se ejecutarán en paralelo en carriles individuales. Dependiendo del número de moléculas diferentes, cada carril muestra la separación de los componentes de la mezcla original como una o más bandas distintas, una banda por componente. La separación incompleta de los componentes puede dar lugar a bandas superpuestas o frotis indistinguibles que representan múltiples componentes no resueltos. [ cita requerida ] Las bandas en diferentes carriles que terminan a la misma distancia de la parte superior contienen moléculas que pasaron a través del gel a la misma velocidad, lo que generalmente significa que tienen aproximadamente el mismo tamaño. Hay marcadores de tamaño de peso molecular disponibles que contienen una mezcla de moléculas de tamaños conocidos. Si dicho marcador se corrió en un carril del gel paralelo a las muestras desconocidas, las bandas observadas se pueden comparar con las de las desconocidas para determinar su tamaño. La distancia que recorre una banda es aproximadamente inversamente proporcional al logaritmo del tamaño de la molécula. [ cita requerida ]
Existen límites para las técnicas electroforéticas. Dado que el paso de una corriente a través de un gel provoca calentamiento, los geles pueden derretirse durante la electroforesis. La electroforesis se realiza en soluciones tampón para reducir los cambios de pH debidos al campo eléctrico, lo cual es importante porque la carga de ADN y ARN depende del pH, pero el funcionamiento durante demasiado tiempo puede agotar la capacidad tampón de la solución. También existen limitaciones para determinar el peso molecular mediante SDS-PAGE, especialmente cuando se intenta encontrar el MW de una proteína desconocida. Ciertas variables biológicas son difíciles o imposibles de minimizar y pueden afectar la migración electroforética. Dichos factores incluyen la estructura de la proteína, las modificaciones postraduccionales y la composición de aminoácidos. Por ejemplo, la tropomiosina es una proteína ácida que migra de forma anormal en los geles SDS-PAGE. Esto se debe a que los residuos ácidos son repelidos por el SDS cargado negativamente, lo que conduce a una migración y una relación masa-carga inexactas. [7] Además, es posible que diferentes preparaciones de material genético no migren de manera coherente entre sí, por razones morfológicas o de otro tipo.
Tipos de gel
Los tipos de gel más utilizados son los geles de agarosa y poliacrilamida. Cada tipo de gel se adapta bien a diferentes tipos y tamaños del analito. Los geles de poliacrilamida se utilizan generalmente para proteínas y tienen un poder de resolución muy alto para pequeños fragmentos de ADN (5-500 pb). Los geles de agarosa, por otro lado, tienen menor poder de resolución para el ADN, pero tienen un mayor rango de separación y, por lo tanto, se utilizan para fragmentos de ADN de tamaño generalmente de 50 a 20 000 pb, pero la resolución de más de 6 Mb es posible con campo pulsado. electroforesis en gel (PFGE). [8] Los geles de poliacrilamida se ejecutan en una configuración vertical, mientras que los geles de agarosa generalmente se ejecutan horizontalmente en modo submarino. También difieren en su metodología de fundición, ya que la agarosa fragua térmicamente, mientras que la poliacrilamida se forma en una reacción de polimerización química.
Agarosa
Los geles de agarosa están hechos de polímeros de polisacáridos naturales extraídos de las algas . Los geles de agarosa se moldean y manipulan fácilmente en comparación con otras matrices porque el fraguado del gel es un cambio físico más que químico. Las muestras también se recuperan fácilmente. Una vez finalizado el experimento, el gel resultante se puede almacenar en una bolsa de plástico en un refrigerador.
Los geles de agarosa no tienen un tamaño de poro uniforme, pero son óptimos para la electroforesis de proteínas de más de 200 kDa. [9] La electroforesis en gel de agarosa también se puede utilizar para la separación de fragmentos de ADN que van desde 50 pares de bases hasta varias megabases (millones de bases) [ cita requerida ] , la mayor de las cuales requiere un aparato especializado. La distancia entre las bandas de ADN de diferentes longitudes está influenciada por el porcentaje de agarosa en el gel, y los porcentajes más altos requieren tiempos de ejecución más largos, a veces días. En su lugar, los geles de agarosa de alto porcentaje deben procesarse con electroforesis de campo pulsado (PFE) o electroforesis de inversión de campo .
"La mayoría de los geles de agarosa se elaboran con entre 0,7% (buena separación o resolución de fragmentos de ADN grandes de 5 a 10 kb) y 2% (buena resolución para fragmentos pequeños de 0,2 a 1 kb) de agarosa disuelta en tampón de electroforesis. Se puede utilizar hasta un 3% para separando fragmentos muy pequeños, pero un gel de poliacrilamida vertical es más apropiado en este caso. Los geles de bajo porcentaje son muy débiles y pueden romperse cuando intenta levantarlos. Los geles de alto porcentaje a menudo son frágiles y no se fijan uniformemente. muchas aplicaciones ". [10]
Poliacrilamida
La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) se utiliza para separar proteínas que varían en tamaño de 5 a 2.000 kDa debido al tamaño de poro uniforme proporcionado por el gel de poliacrilamida. El tamaño de los poros se controla modulando las concentraciones de polvo de acrilamida y bis-acrilamida que se utilizan para crear un gel. Se debe tener cuidado al crear este tipo de gel, ya que la acrilamida es una potente neurotoxina en sus formas líquidas y en polvo.
Las técnicas tradicionales de secuenciación de ADN , como los métodos de Maxam-Gilbert o Sanger , utilizaban geles de poliacrilamida para separar fragmentos de ADN que diferían en un solo par de bases en longitud para poder leer la secuencia. La mayoría de los métodos modernos de separación de ADN utilizan ahora geles de agarosa, excepto para fragmentos de ADN particularmente pequeños. Actualmente se usa con mayor frecuencia en el campo de la inmunología y el análisis de proteínas, y se usa a menudo para separar diferentes proteínas o isoformas de la misma proteína en bandas separadas. Estos pueden transferirse a una membrana de nitrocelulosa o PVDF para sondearse con anticuerpos y los marcadores correspondientes, como en una transferencia Western .
Normalmente, los geles de resolución se fabrican en 6%, 8%, 10%, 12% o 15%. El gel de apilamiento (5%) se vierte sobre el gel de resolución y se inserta un peine de gel (que forma los pozos y define los carriles donde se colocarán las proteínas, el tampón de muestra y las escaleras). El porcentaje elegido depende del tamaño de la proteína que se desea identificar o sondear en la muestra. Cuanto menor sea el peso conocido, mayor será el porcentaje que se debe utilizar. Los cambios en el sistema tampón del gel pueden ayudar a resolver aún más las proteínas de tamaños muy pequeños. [11]
Almidón
El almidón de patata parcialmente hidrolizado constituye otro medio no tóxico para la electroforesis de proteínas. Los geles son ligeramente más opacos que la acrilamida o la agarosa. Las proteínas no desnaturalizadas se pueden separar según la carga y el tamaño. Se visualizan mediante tinción con Napthal Black o Amido Black. Las concentraciones típicas de gel de almidón son del 5% al 10%. [12] [13] [14]
Condiciones de gel
Desnaturalizante
Los geles desnaturalizantes se procesan en condiciones que alteran la estructura natural del analito, provocando que se despliegue en una cadena lineal. Por lo tanto, la movilidad de cada macromolécula depende solo de su longitud lineal y su relación masa-carga. Por lo tanto, los niveles secundario, terciario y cuaternario de la estructura biomolecular se interrumpen, dejando solo la estructura primaria para analizar.
Los ácidos nucleicos a menudo se desnaturalizan al incluir urea en el tampón, mientras que las proteínas se desnaturalizan usando dodecilsulfato de sodio , generalmente como parte del proceso SDS-PAGE . Para la desnaturalización completa de las proteínas, también es necesario reducir los enlaces disulfuro covalentes que estabilizan su estructura terciaria y cuaternaria , un método llamado PAGE reductor. Las condiciones reductoras se mantienen habitualmente mediante la adición de beta-mercaptoetanol o ditiotreitol . Para un análisis general de muestras de proteínas, la reducción de PAGE es la forma más común de electroforesis de proteínas .
Las condiciones de desnaturalización son necesarias para la estimación adecuada del peso molecular del ARN. El ARN puede formar más interacciones intramoleculares que el ADN, lo que puede provocar cambios en su movilidad electroforética . La urea , el DMSO y el glioxal son los agentes desnaturalizantes más utilizados para alterar la estructura del ARN. Originalmente, el hidróxido de metilmercurio altamente tóxico se usaba a menudo para desnaturalizar la electroforesis de ARN, [15] pero puede ser el método de elección para algunas muestras. [dieciséis]
La electroforesis en gel desnaturalizante se utiliza en los métodos basados en patrones de bandas de ADN y ARN , electroforesis en gel en gradiente de temperatura (TGGE) [17] y electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante (DGGE). [18]
Nativo
Los geles nativos se procesan en condiciones no desnaturalizantes para que se mantenga la estructura natural del analito. Esto permite que el tamaño físico del complejo plegado o ensamblado afecte la movilidad, lo que permite el análisis de los cuatro niveles de la estructura biomolecular. Para las muestras biológicas, los detergentes se utilizan solo en la medida en que sean necesarios para lisar las membranas lipídicas en la célula . Los complejos permanecen, en su mayor parte, asociados y plegados como lo estarían en la celda. Sin embargo, una desventaja es que los complejos pueden no separarse de manera limpia o predecible, ya que es difícil predecir cómo la forma y el tamaño de la molécula afectarán su movilidad. Abordar y resolver este problema es un objetivo principal de PAGE nativo cuantitativo .
A diferencia de los métodos de desnaturalización, la electroforesis en gel nativo no utiliza un agente desnaturalizante cargado . Por lo tanto, las moléculas que se separan (generalmente proteínas o ácidos nucleicos ) difieren no solo en la masa molecular y la carga intrínseca, sino también en el área de la sección transversal y, por lo tanto, experimentan diferentes fuerzas electroforéticas que dependen de la forma de la estructura general. En el caso de las proteínas, dado que permanecen en el estado nativo, pueden visualizarse no solo mediante reactivos de tinción de proteínas generales, sino también mediante tinciones específicas ligadas a enzimas.
Un ejemplo de experimento específico de una aplicación de electroforesis en gel nativo es verificar la actividad enzimática para verificar la presencia de la enzima en la muestra durante la purificación de proteínas. Por ejemplo, para la proteína fosfatasa alcalina, la solución de tinción es una mezcla de sal de 4-cloro-2-2metilbencendiazonio con ácido 3-fosfo-2-naftoico-2'-4'-dimetil anilina en tampón Tris. Esta mancha se vende comercialmente como un kit para teñir geles. Si la proteína está presente, el mecanismo de reacción tiene lugar en el siguiente orden: comienza con la desfosforilación del ácido 3-fosfo-2-naftoico-2'-4'-dimetil anilina por la fosfatasa alcalina (se necesita agua para la reacción). El grupo fosfato se libera y se reemplaza por un grupo alcohol del agua. El electrófilo 4- cloro-2-2 metilbencendiazonio (sal de diazonio Fast Red TR) desplaza el grupo alcohol formando el producto final del tinte Red Azo. Como su nombre lo indica, este es el producto final de color rojo visible de la reacción. En la experimentación académica de pregrado de la purificación de proteínas, el gel generalmente se ejecuta junto a muestras comerciales purificadas para visualizar los resultados y concluir si la purificación fue exitosa o no. [20]
La electroforesis en gel nativo se usa típicamente en proteómica y metalómica . Sin embargo, la PAGE nativa también se usa para escanear genes (ADN) en busca de mutaciones desconocidas como en el polimorfismo de conformación monocatenario .
Amortiguadores
Los tampones en la electroforesis en gel se utilizan para proporcionar iones que transportan una corriente y para mantener el pH a un valor relativamente constante. Estos tampones contienen muchos iones, lo cual es necesario para el paso de la electricidad a través de ellos. Algo como el agua destilada o el benceno contiene pocos iones, lo que no es ideal para su uso en electroforesis. [21] Hay una serie de tampones que se utilizan para la electroforesis. El más común es, para los ácidos nucleicos Tris / Acetato / EDTA (TAE), Tris / Borato / EDTA (TBE). Se han propuesto muchos otros tampones, por ejemplo, borato de litio , que se usa raramente, basados en citas de Pubmed (LB), histidina isoeléctrica, tampones de productos emparejados con pK, etc .; en la mayoría de los casos, el supuesto fundamento es una menor movilidad de iones adaptada a la corriente (menos calor), lo que conduce a una vida útil más prolongada. El borato es problemático; El borato puede polimerizar o interactuar con cis dioles como los que se encuentran en el ARN. TAE tiene la capacidad de amortiguación más baja, pero proporciona la mejor resolución para ADN más grande. Esto significa un voltaje más bajo y más tiempo, pero un mejor producto. LB es relativamente nuevo y es ineficaz para resolver fragmentos mayores de 5 kpb; Sin embargo, con su baja conductividad, se podría usar un voltaje mucho más alto (hasta 35 V / cm), lo que significa un tiempo de análisis más corto para la electroforesis de rutina. Se pudo resolver una diferencia de tamaño tan baja como un par de bases en gel de agarosa al 3% con un medio de conductividad extremadamente baja (borato de litio 1 mM). [22]
La mayoría de las separaciones de proteínas SDS-PAGE se realizan utilizando un sistema tampón "discontinuo" (o DISC) que mejora significativamente la nitidez de las bandas dentro del gel. Durante la electroforesis en un sistema de gel discontinuo, se forma un gradiente de iones en la etapa inicial de la electroforesis que hace que todas las proteínas se enfoquen en una sola banda nítida en un proceso llamado isotacoforesis . La separación de las proteínas por tamaño se logra en la región de "resolución" inferior del gel. El gel de resolución normalmente tiene un tamaño de poro mucho más pequeño, lo que conduce a un efecto de tamizado que ahora determina la movilidad electroforética de las proteínas.
Visualización
Una vez completada la electroforesis, las moléculas del gel se pueden teñir para hacerlas visibles. El ADN se puede visualizar usando bromuro de etidio que, cuando se intercala en el ADN, presenta fluorescencia bajo luz ultravioleta , mientras que la proteína se puede visualizar usando tinción de plata o tinte azul brillante de Coomassie . También se pueden usar otros métodos para visualizar la separación de los componentes de la mezcla en el gel. Si las moléculas a separar contienen radiactividad , por ejemplo en un gel de secuenciación de ADN , se puede registrar un autorradiograma del gel. Se pueden tomar fotografías de geles, a menudo utilizando un sistema Gel Doc .
Procesamiento en bajada
Después de la separación, se puede utilizar un método de separación adicional, como el enfoque isoeléctrico o SDS-PAGE . A continuación, se cortará físicamente el gel y se extraerán los complejos de proteínas de cada porción por separado. A continuación, cada extracto puede analizarse, por ejemplo, mediante huella dactilar de masa de péptidos o secuenciación de péptidos de novo después de la digestión en gel . Esto puede proporcionar una gran cantidad de información sobre las identidades de las proteínas en un complejo.
Aplicaciones
- Estimación del tamaño de las moléculas de ADN después de la digestión con enzimas de restricción, por ejemplo, en el mapeo de restricción del ADN clonado.
- Análisis de productos de PCR , por ejemplo, en diagnóstico genético molecular o huellas dactilares genéticas
- Separación de ADN genómico restringido antes de la transferencia de Southern , o de ARN antes de la transferencia de Northern .
La electroforesis en gel se utiliza en medicina forense , biología molecular , genética , microbiología y bioquímica . Los resultados se pueden analizar cuantitativamente visualizando el gel con luz ultravioleta y un dispositivo de formación de imágenes de gel. La imagen se registra con una cámara operada por computadora, y la intensidad de la banda o el punto de interés se mide y se compara con el estándar o los marcadores cargados en el mismo gel. La medición y el análisis se realizan principalmente con software especializado.
Dependiendo del tipo de análisis que se realice, a menudo se implementan otras técnicas junto con los resultados de la electroforesis en gel, lo que proporciona una amplia gama de aplicaciones específicas de campo.
Ácidos nucleicos
En el caso de los ácidos nucleicos, la dirección de la migración, de los electrodos negativos a los positivos, se debe a la carga negativa de origen natural que lleva su esqueleto de azúcar y fosfato . [23]
Los fragmentos de ADN de doble hebra se comportan naturalmente como varillas largas, por lo que su migración a través del gel es relativa a su tamaño o, para los fragmentos cíclicos, a su radio de giro . Sin embargo, el ADN circular, como los plásmidos , puede mostrar múltiples bandas, la velocidad de migración puede depender de si está relajado o superenrollado. El ADN o ARN monocatenario tiende a plegarse en moléculas con formas complejas y a migrar a través del gel de una manera complicada en función de su estructura terciaria. Por lo tanto, los agentes que rompen los enlaces de hidrógeno , como el hidróxido de sodio o la formamida , se utilizan para desnaturalizar los ácidos nucleicos y hacer que se comporten nuevamente como bastones largos. [24]
La electroforesis en gel de ADN o ARN grandes generalmente se realiza mediante electroforesis en gel de agarosa. Consulte la página " Método de terminación de la cadena " para ver un ejemplo de un gel de secuenciación de ADN de poliacrilamida. La caracterización a través de la interacción de ligandos de ácidos nucleicos o fragmentos puede realizarse mediante electroforesis de afinidad por cambio de movilidad .
La electroforesis de muestras de ARN se puede utilizar para verificar la contaminación del ADN genómico y también la degradación del ARN. El ARN de organismos eucariotas muestra distintas bandas de ARNr 28s y 18s, siendo la banda 28s aproximadamente dos veces más intensa que la banda 18s. El ARN degradado tiene bandas menos definidas, tiene un aspecto manchado y la relación de intensidad es inferior a 2: 1.
Proteínas
Las proteínas , a diferencia de los ácidos nucleicos, pueden tener cargas variables y formas complejas, por lo tanto, es posible que no migren al gel de poliacrilamida a velocidades similares, o todas al colocar un EMF negativo a positivo en la muestra. Por lo tanto, las proteínas generalmente se desnaturalizan en presencia de un detergente como el dodecilsulfato de sodio (SDS) que recubre las proteínas con una carga negativa. [3] Generalmente, la cantidad de SDS unida es relativa al tamaño de la proteína (generalmente 1,4 g de SDS por gramo de proteína), de modo que las proteínas desnaturalizadas resultantes tienen una carga negativa general y todas las proteínas tienen una carga similar. relación a masa. Dado que las proteínas desnaturalizadas actúan como varillas largas en lugar de tener una forma terciaria compleja, la velocidad a la que las proteínas recubiertas de SDS resultantes migran en el gel es relativa solo a su tamaño y no a su carga o forma. [3]
Las proteínas se analizan normalmente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio ( SDS-PAGE ), mediante electroforesis en gel nativo, mediante electroforesis en gel preparativa ( QPNC-PAGE ) o mediante electroforesis bidimensional .
La caracterización mediante la interacción del ligando se puede realizar mediante electrotransferencia o mediante electroforesis de afinidad en agarosa o mediante electroforesis capilar para la estimación de las constantes de unión y la determinación de características estructurales como el contenido de glucanos mediante la unión de lectina .
Nanopartículas
Una nueva aplicación para la electroforesis en gel es separar o caracterizar nanopartículas de metal o de óxido metálico (por ejemplo, Au, Ag, ZnO, SiO2) con respecto al tamaño, la forma o la química de la superficie de las nanopartículas. El alcance es obtener una muestra más homogénea (por ejemplo, una distribución de tamaño de partículas más estrecha), que se puede utilizar en otros productos / procesos (por ejemplo, procesos de autoensamblaje). Para la separación de nanopartículas dentro de un gel, el tamaño de partícula alrededor del tamaño de la malla es el parámetro clave, mediante el cual se identificaron dos mecanismos de migración: el mecanismo no restringido, donde el tamaño de partícula << tamaño de malla, y el mecanismo restringido, donde el tamaño de partícula es similar al tamaño de la malla. [25]
Historia
- Década de 1930: primeros informes del uso de sacarosa para electroforesis en gel
- 1955 - introducción de geles de almidón , separación mediocre (Smithies) [13]
- 1959 - introducción de geles de acrilamida; electroforesis de disco (Ornstein y Davis); control preciso de parámetros como el tamaño de los poros y la estabilidad; y (Raymond y Weintraub)
- 1966 - primer uso de geles de agar [26]
- 1969 - introducción de agentes desnaturalizantes , especialmente separación de SDS de subunidades de proteínas (Weber y Osborn) [27]
- 1970 - Laemmli separó 28 componentes del fago T4 usando un gel de apilamiento y SDS
- 1972 - geles de agarosa con tinción con bromuro de etidio [28]
- 1975 - geles bidimensionales (O'Farrell); enfoque isoeléctrico y luego electroforesis en gel SDS
- 1977 - geles de secuenciación
- 1983: la electroforesis en gel de campo pulsado permite la separación de grandes moléculas de ADN
- 1983 - introducción de la electroforesis capilar
- 2004: la introducción de un tiempo estandarizado de polimerización de geles de acrilamida permite una separación limpia y predecible de proteínas nativas (Kastenholz) [29]
Un libro de 1959 sobre electroforesis de Milan Bier cita referencias del siglo XIX. [30] Sin embargo, Oliver Smithies hizo contribuciones significativas. Bier afirma: "El método de Herrería ... está encontrando una amplia aplicación debido a su poder separador único". Tomado en contexto, Bier claramente implica que el método de Smithies es una mejora.
Ver también
- Software de análisis de gel 2D
- Historia de la electroforesis
- Ensayo de cambio de movilidad electroforética
- Extracción de gel
- Enfoque isoeléctrico
- Electroforesis en gel de campo pulsado
- Frictioforesis no lineal
- Electroforesis en gel bidimensional
- SDD-AGE
- Zimografía
- Proteólisis rápida paralela [31]
Referencias
- ^ Kryndushkin DSTer-Avanesyan MD, Kushnirov VV (2003). "Los agregados de priones de levadura [PSI +] están formados por pequeños polímeros Sup35 fragmentados por Hsp104" . Revista de Química Biológica . 278 (49): 49636–43. doi : 10.1074 / jbc.M307996200 . PMID 14507919 .
- ^ Sambrook J, Russel DW (2001). Clonación molecular: Manual de laboratorio 3ª Ed. Prensa de laboratorio de Cold Spring Harbor. Cold Spring Harbor, Nueva York.
- ^ a b c Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L (2002). Bioquímica (5ª ed.). WH Freeman. ISBN 978-0-7167-4955-4.
- ^ Hofmann, Andreas; Clokie, Samuel, eds. (19 de abril de 2018). Principios y técnicas de bioquímica y biología molecular de Wilson y Walker . Gran Bretaña: Cambridge University Press. ISBN 9781316614761.
- ^ Boyer, Rodney F. (20 de agosto de 2000). Bioquímica experimental moderna . EE.UU .: Pearson, 3ª edición. ISBN 978-0805331110.
- ^ Robyt, John F .; White, Bernard J. (1990). Teoría y práctica de las técnicas bioquímicas . Waveland Press. ISBN 978-0-88133-556-9.
- ^ "Determinación del peso molecular por SDS-PAGE" (PDF) . www.bio-rad.com .
- ^ Tom Maniatis; EF Fritsch; Joseph Sambrook (1982). "Capítulo 5, protocolo 1". Clonación molecular: manual de laboratorio . 1 (3ª ed.). pag. 5.2–5.3. ISBN 978-0879691363.
- ^ Smisek, DL; Hoagland, DA (1989). "Electroforesis en gel de agarosa de polielectrolitos sintéticos de alto peso molecular". Macromoléculas . 22 (5): 2270–2277. Código Bibliográfico : 1989MaMol..22.2270S . doi : 10.1021 / ma00195a048 .
- ^ "Electroforesis en gel de agarosa (método básico)" . Protocolos biológicos . Consultado el 23 de agosto de 2011 .
- ^ Schägger, Hermann (2006). "Tricina – SDS-PAGE". Protocolos de la naturaleza . 1 (1): 16-22. doi : 10.1038 / nprot.2006.4 . PMID 17406207 . S2CID 209529082 .
- ^ Gordon, AH (1975). Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida y almidón . Nueva York: American Elsevier Publishing Company, Inc.
- ^ a b Herrería, O. (1955). "Electroforesis de zona en geles de almidón: variaciones de grupo en las proteínas séricas de adultos normales" . Biochem. J . 61 (4): 629–641. doi : 10.1042 / bj0610629 . PMC 1215845 . PMID 13276348 .
- ^ Wraxall, BGD; Culliford, BJ (1968). "Un método de gel de almidón de capa fina para la tipificación enzimática de manchas de sangre". J. Forensic Sci. Soc . 8 (2): 81–82. doi : 10.1016 / S0015-7368 (68) 70449-7 . PMID 5738223 .
- ^ Buell, GN; Wickens, diputado; Payvar, F; Schimke, RT (10 de abril de 1978). "Síntesis de ADNc de longitud completa de cuatro ARNm de oviducto parcialmente purificado". La revista de química biológica . 253 (7): 2471–82. PMID 632280 .
- ^ Schelp, C; Kaaden, OR (mayo de 1989). "Transcripción completa mejorada del ARN del virus Sindbis por desnaturalización efectiva con hidróxido de metilmercurio". Acta Virologica . 33 (3): 297-302. PMID 2570517 .
- ^ Fromin N, Hamelin J, Tarnawski S, Roesti D, Jourdain-Miserez K, Forestier N, Teyssier-Cuvelle S, Gillet F, Aragno M, Rossi P (noviembre de 2002). "Análisis estadístico de patrones de huellas dactilares de electroforesis en gel desnaturalizante (DGE)" (PDF) . Reinar. Microbiol . 4 (11): 634–43. doi : 10.1046 / j.1462-2920.2002.00358.x . PMID 12460271 .
- ^ Fischer SG, Lerman LS (enero de 1979). "Separación independiente de la longitud de fragmentos de restricción de ADN en electroforesis en gel bidimensional". Celular . 16 (1): 191–200. doi : 10.1016 / 0092-8674 (79) 90200-9 . PMID 369706 . S2CID 9369012 .
- ^ Hempelmann E, Wilson RJ (1981). "Detección de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa en parásitos de la malaria". Parasitología molecular y bioquímica . 2 (3-4): 197-204. doi : 10.1016 / 0166-6851 (81) 90100-6 . PMID 7012616 .
- ^ Ninfa AJ, Ballou DP (1998). Enfoques fundamentales de la bioquímica y la biotecnología . Bethesda, Maryland: Fitzgerald Science Press. ISBN 9781891786006.
- ^ Ninfa, Alexander J .; Ballou, David P .; Benore, Marilee (2009). enfoques de laboratorio fundamentales para la bioquímica y la biotecnología . Hoboken, Nueva Jersey: Wiley. pag. 161. ISBN 978-0470087664.
- ^ Brody JR, Kern SE (octubre de 2004). "Historia y principios de los medios conductores para electroforesis de ADN estándar" (PDF) . Anal. Biochem . 333 (1): 1–13. doi : 10.1016 / j.ab.2004.05.054 . PMID 15351274 .
- ^ Lodish H; Berk A; Matsudaira P (2004). Biología celular molecular (5ª ed.). WH Freeman: Nueva York, NY. ISBN 978-0-7167-4366-8.
- ^ Solución de problemas de electroforesis en gel de agarosa de ADN. Focus 19: 3 p.66 (1997).
- ^ Barasinski, M .; Garnweitner, G. Mecanismos de migración restringidos y no restringidos de nanopartículas de sílice en geles de agarosa y su utilización para la separación de mezclas binarias. J. Phys. Chem. C. 2020 , 124, 5157-5166. https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jpcc.9b10644
- ^ Thorne HV (1966). "Separación electroforética del ADN del virus del polioma del ADN de la célula huésped". Virología . 29 (2): 234–9. doi : 10.1016 / 0042-6822 (66) 90029-8 . PMID 4287545 .
- ^ Weber, K; Osborn, M (1969). "La fiabilidad de las determinaciones de peso molecular por electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato". La revista de química biológica . 244 (16): 4406–12. PMID 5806584 .
- ^ Aaij C, Borst P (1972). "La electroforesis en gel del ADN". Biochim Biophys Acta . 269 (2): 192–200. doi : 10.1016 / 0005-2787 (72) 90426-1 . PMID 5063906 .
- ^ Kastenholz B (2004). "Electroforesis en gel de poliacrilamida continua nativa preparativa (PNC-PAGE): un método eficaz para aislar cofactores de cadmio en sistemas biológicos". Cartas analíticas . 37 (4): 657–665. doi : 10.1081 / AL-120029742 . S2CID 97636537 .
- ^ Milán Bier (1959). Electroforesis. Teoría, métodos y aplicaciones (3ª ed.). Prensa académica. pag. 225. OCLC 1175404 . LCC 59-7676.
- ^ Minde DP (2012). "Determinación de la estabilidad biofísica de proteínas en lisados mediante un ensayo de proteólisis rápida, FASTpp" . PLOS One . 7 (10): e46147. Código Bibliográfico : 2012PLoSO ... 746147M . doi : 10.1371 / journal.pone.0046147 . PMC 3463568 . PMID 23056252 .
enlaces externos
- Demostración de electroforesis en el laboratorio de biotecnología , del Centro de Aprendizaje de Ciencias Genéticas de la Universidad de Utah
- Electroforesis discontinua en gel de proteína nativa
- Electroforesis con pajita
- Cómo ejecutar un gel de ADN o ARN
- Animación de análisis de gel de restricción de ADN
- Fotos paso a paso de ejecutar un gel y extraer ADN
- Un método típico de la wikiversidad.
- Manual de métodos y principios de electroforesis bidimensional