La edición principal es una tecnología de edición del genoma de "búsqueda y reemplazo" en biología molecular mediante la cual se puede modificar el genoma de los organismos vivos. La tecnología escribe directamente nueva información genética en un sitio de ADN específico. Utiliza una proteína de fusión , que consiste en una endonucleasa Cas9 con deterioro catalítico fusionada a una enzima transcriptasa inversa diseñada y un ARN guía de edición principal (pegRNA), capaz de identificar el sitio objetivo y proporcionar la nueva información genética para reemplazar los nucleótidos del ADN objetivo. Interviene en inserciones y eliminaciones específicas .y conversiones de base a base sin la necesidad de roturas de doble hebra (DSB) o plantillas de ADN del donante. [1]
La tecnología es un método de edición del genoma experimental en etapa temprana que ha recibido la atención de la prensa generalizada debido a sus usos potenciales en genética médica. Utiliza metodologías similares a las tecnologías de edición del genoma precursoras, incluidos CRISPR / Cas9 y editores básicos. A partir de 2019, sigue siendo una prueba científica de concepto, sin aplicaciones terapéuticas. [1]
Edición del genoma
Componentes
La edición principal incluye tres componentes principales: [1]
- Un ARN guía de edición principal (pegRNA) , capaz de (i) identificar la secuencia de nucleótidos diana que se va a editar y (ii) codificar nueva información genética que reemplaza la secuencia diana. El pegRNA consiste en un RNA guía único extendido (sgRNA) que contiene un sitio de unión del cebador (PBS) y una secuencia de plantilla de transcriptasa inversa (RT). Durante la edición del genoma, el sitio de unión del cebador permite que el extremo 3 'de la hebra de ADN mellada se hibride con el pegRNA, mientras que la plantilla RT sirve como plantilla para la síntesis de información genética editada. [1]
- Una proteína de fusión que consta de una ninfasa Cas9 H840A fusionada con una transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV) . [1]
- Nickasa Cas9 H840A: la enzima Cas9 contiene dos dominios nucleasa que pueden escindir secuencias de ADN, un dominio RuvC que escinde la hebra no diana y un dominio HNH que escinde la hebra diana. La introducción de una sustitución H840A en Cas9, mediante la cual el aminoácido histidina de 840º es reemplazado por una alanina, inactiva el dominio HNH. Con solo el dominio de funcionamiento RuvC, el Cas9 deteriorado catalíticamente introduce una hebra única, de ahí el nombre nickase . [2]
- Transcriptasa inversa M-MLV: enzima que sintetiza ADN a partir de una plantilla de ARN monocatenario. [1]
- Un solo ARN guía (ARNsg) que dirige la porción de níquelase Cas9 H840A de la proteína de fusión para cortar la hebra de ADN no editada. [1]
Mecanismo
La edición genómica se lleva a cabo mediante la transfección de células con el pegRNA y la proteína de fusión. La transfección a menudo se logra mediante la introducción de vectores en una célula. Una vez internalizada, la proteína de fusión corta la secuencia de ADN diana, exponiendo un grupo 3'-hidroxilo que puede usarse para iniciar (cebar) la transcripción inversa de la porción de plantilla de RT del pegRNA. Esto da como resultado un intermedio ramificado que contiene dos colgajos de ADN: un colgajo 3 'que contiene la secuencia recién sintetizada (editada) y un colgajo 5' que contiene la secuencia de ADN prescindible y sin editar. A continuación, el colgajo 5 'se escinde mediante endonucleasas específicas de estructura o exonucleasas 5' . Este proceso permite la ligadura del colgajo 3 'y crea un ADN heterodúplex compuesto por una hebra editada y una hebra sin editar. El ADN bicatenario reescalado contiene desajustes de nucleótidos en el lugar donde tuvo lugar la edición. Para corregir los desajustes, las células explotan el mecanismo intrínseco de reparación de desajustes , con dos posibles resultados: (i) la información en la cadena editada se copia en la cadena complementaria, instalando permanentemente la edición; (ii) los nucleótidos originales se vuelven a incorporar en la cadena editada, excluyendo la edición. [1]
Proceso de desarrollo
Durante el desarrollo de esta tecnología, se realizaron varias modificaciones a los componentes, con el fin de incrementar su efectividad. [1]
Editor principal 1
En el primer sistema, una transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (M-MLV) de tipo salvaje se fusionó con el extremo C de la nickasa Cas9 H840A. Se observaron eficiencias de edición detectables. [1]
Prime editor 2
Para mejorar la afinidad ADN-ARN, la procesividad enzimática y la termoestabilidad, se incorporaron cinco sustituciones de aminoácidos en la transcriptasa inversa M-MLV. El mutante M-MLV RT se incorporó luego en PE1 para dar lugar a (Cas9 (H840A) -M-MLV RT (D200N / L603W / T330P / T306K / W313F)). Se observó una mejora de la eficiencia sobre PE1. [1]
Prime editor 3
A pesar de su mayor eficacia, la edición insertada por PE2 aún podría eliminarse debido a la reparación de errores de emparejamiento de ADN de la cadena editada. Para evitar este problema durante la resolución de heterodúplex de ADN, se introduce un ARN guía único adicional (ARNsg). Este sgRNA está diseñado para coincidir con la secuencia editada introducida por el pegRNA, pero no con el alelo original. Dirige la porción de nickasa Cas9 de la proteína de fusión para cortar la hebra no editada en un sitio cercano, opuesto al corte original. Al cortar la hebra no editada, el sistema de reparación natural de la célula copia la información de la hebra editada en la hebra complementaria, instalando permanentemente la edición. [1]
Trascendencia
Aunque se requiere investigación adicional para mejorar la eficiencia de la edición principal, la tecnología ofrece mejoras científicas prometedoras sobre otras herramientas de edición de genes. La tecnología de edición principal tiene el potencial de corregir la gran mayoría de los alelos patógenos que causan enfermedades genéticas, ya que puede reparar inserciones, deleciones y sustituciones de nucleótidos. [1]
Ventajas
La herramienta de edición principal ofrece ventajas sobre las tecnologías tradicionales de edición de genes. Las ediciones CRISPR / Cas9 se basan en la unión de extremos no homólogos (NHEJ) o la reparación dirigida por homología (HDR) para corregir las roturas del ADN, mientras que el sistema de edición principal emplea la reparación de los desajustes del ADN . Esta es una característica importante de esta tecnología dado que los mecanismos de reparación del ADN, como NHEJ y HDR, generan subproductos de inserciones o deleciones aleatorias no deseadas (INDEL) que complican la recuperación de células que llevan la edición correcta. [1] [3]
El sistema principal introduce roturas de ADN de una sola hebra en lugar de las roturas de ADN de doble hebra que se observan en otras herramientas de edición, como los editores de bases. En conjunto, la edición básica y la edición principal ofrecen fortalezas y debilidades complementarias para realizar mutaciones de transición específicas. Los editores de base ofrecen una mayor eficiencia de edición y menos subproductos INDEL si la edición deseada es una mutación de punto de transición y existe una secuencia PAM aproximadamente a 15 bases del sitio de destino. Sin embargo, debido a que la tecnología de edición principal requiere una secuencia PAM posicionada con precisión para apuntar a una secuencia de nucleótidos, ofrece más flexibilidad y precisión de edición. Sorprendentemente, los editores principales permiten insertar todo tipo de sustituciones, transiciones y transversiones en la secuencia de destino. [1] [3]
Debido a que el sistema principal implica tres eventos de unión al ADN separados (entre (i) la secuencia guía y el ADN diana, (ii) el sitio de unión del cebador y el ADN diana, y (iii) el extremo 3 'de la hebra de ADN mellada y el pegRNA), se ha sugerido que tiene menos efectos indeseables fuera del objetivo que CRISPR / Cas9 . [1] [3]
Limitaciones
Existe un interés considerable en la aplicación de métodos de edición de genes al tratamiento de enfermedades con un componente genético. Sin embargo, existen múltiples desafíos asociados con este enfoque. Un tratamiento eficaz requeriría la edición de una gran cantidad de células diana, lo que a su vez requeriría un método de administración eficaz y un gran nivel de especificidad tisular. [1] [4]
A partir de 2019, la edición principal parece prometedora para alteraciones genéticas relativamente pequeñas, pero es necesario realizar más investigaciones para evaluar si la tecnología es eficiente para realizar alteraciones más grandes, como inserciones y deleciones específicas. Las alteraciones genéticas más grandes requerirían una plantilla de RT más larga, lo que podría dificultar la entrega eficiente de pegRNA a las células diana. Además, un pegRNA que contenga una plantilla de RT larga podría volverse vulnerable al daño causado por las enzimas celulares. [1] [4]
En general, se necesitará mucha investigación antes de que se pueda utilizar la edición principal para corregir alelos patógenos en enfermedades humanas. [1] [4]
Método de entrega
Los editores de base utilizados para la edición principal requieren la administración de una proteína y una molécula de ARN a las células vivas. La introducción de tecnologías de edición de genes exógenos en organismos vivos es un desafío importante. Una forma potencial de introducir un editor base en animales y plantas sería empaquetar el editor base en una cápside viral. A continuación, el virus puede transducir el organismo diana para sintetizar el editor de base in vivo . Los vectores de transducción de laboratorio habituales, como los lentivirus, provocan respuestas inmunitarias en los seres humanos, por lo que las terapias humanas propuestas a menudo se centran en el virus adenoasociado (AAV) porque las infecciones por AAV son en gran medida asintomáticas. Desafortunadamente, la capacidad de empaquetado efectiva de los vectores AAV es pequeña, aproximadamente 4,4 kb sin incluir las repeticiones terminales invertidas. [5] Como comparación, una proteína de fusión SpCas9-transcriptasa inversa es de 6,3 kb, [6] [7] que ni siquiera tiene en cuenta el ARN guía alargado necesario para apuntar y cebar el sitio de interés.
Ver también
- Genética
- Glosario de genética
- Human Nature (documental de la película CRISPR 2019)
- Biología sintética
- Selección antinatural (documental de televisión de 2019)
Referencias
- ^ a b c d e f g h i j k l m n o p q r s Anzalone, Andrew V .; Randolph, Peyton B .; Davis, Jessie R .; Sousa, Alexander A .; Koblan, Luke W .; Levy, Jonathan M .; Chen, Peter J .; Wilson, Christopher; Newby, Gregory A .; Raguram, Aditya; Liu, David R. (21 de octubre de 2019). "Búsqueda y reemplazo de la edición del genoma sin roturas de doble cadena o ADN del donante" . Naturaleza . 576 (7785): 149-157. Código Bib : 2019Natur.576..149A . doi : 10.1038 / s41586-019-1711-4 . PMC 6907074 . PMID 31634902 .
- ^ Ran, F. Ann; Hsu, Patrick D .; Lin, Chie-Yu; Gootenberg, Jonathan S .; Konermann, Silvana; Treviño, Alexandro E .; Scott, David A .; Inoue, Azusa; Matoba, Shogo; Zhang, Yi; Zhang, Feng (septiembre de 2013). "Double Nicking por CRISPR Cas9 guiado por ARN para mejorar la especificidad de edición del genoma" . Celular . 154 (6): 1380-1389. doi : 10.1016 / j.cell.2013.08.021 . PMC 3856256 . PMID 23992846 .
- ^ a b c Sheridan, Cormac (7 de noviembre de 2019). "La edición de genes entra en tiempo de máxima audiencia". Biotecnología de la naturaleza . doi : 10.1038 / d41587-019-00032-5 .
- ^ a b c "El científico David Liu responde a sus preguntas sobre CRISPR y edición principal" . STAT . 2019-11-06 . Consultado el 28 de febrero de 2020 .
- ^ Wu, Zhijian; Yang, Hongyan; Colosi, Peter (2010). "Efecto del tamaño del genoma en el empaquetado del vector AAV" . Terapia molecular . 18 (1): 80–86. doi : 10.1038 / mt.2009.255 . PMC 2839202 . PMID 19904234 .
- ^ Anzalone, Andrew V .; Randolph, Peyton B .; Davis, Jessie R .; Sousa, Alexander A .; Koblan, Luke W .; Levy, Jonathan M .; Chen, Peter J .; Wilson, Christopher; Newby, Gregory A .; Raguram, Aditya; Liu, David R. (diciembre de 2019). "Búsqueda y reemplazo de la edición del genoma sin roturas de doble cadena o ADN del donante" . Naturaleza . 576 (7785): 149-157. Código Bib : 2019Natur.576..149A . doi : 10.1038 / s41586-019-1711-4 . PMC 6907074 . PMID 31634902 .
- ^ https://www.addgene.org/132775/
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- ^ "Biorender" .