La unión de extremos no homólogos ( NHEJ ) es una vía que repara las roturas de doble hebra en el ADN. NHEJ se denomina "no homólogo" porque los extremos de rotura se ligan directamente sin la necesidad de una plantilla homóloga, en contraste con la reparación dirigida por homología , que requiere una secuencia homóloga para guiar la reparación. El término "unión de extremos no homólogos" fue acuñado en 1996 por Moore y Haber. [1]
El NHEJ suele estar guiado por secuencias cortas de ADN homólogas llamadas microhomologías. Estas microhomologías están presentes a menudo en voladizos monocatenarios en los extremos de las roturas bicatenarias . Cuando los voladizos son perfectamente compatibles, NHEJ suele reparar la rotura con precisión. [1] [2] [3] [4] También puede ocurrir una reparación imprecisa que conduce a la pérdida de nucleótidos, pero es mucho más común cuando los salientes no son compatibles. El NHEJ inadecuado puede provocar translocaciones y fusión de telómeros , características de las células tumorales . [5]
Se entiende que las implementaciones de NHEJ han existido en casi todos los sistemas biológicos y es la ruta de reparación de rotura de doble cadena predominante en células de mamíferos. [6] En la levadura en ciernes ( Saccharomyces cerevisiae ), sin embargo, la recombinación homóloga domina cuando el organismo se cultiva en condiciones comunes de laboratorio.
Cuando la vía NHEJ se inactiva, las roturas de doble hebra pueden repararse mediante una vía más propensa a errores denominada unión final mediada por microhomología (MMEJ). En esta vía, la resección terminal revela microhomologías cortas a ambos lados de la rotura, que luego se alinean para guiar la reparación. [7] Esto contrasta con el NHEJ clásico, que normalmente utiliza microhomologías ya expuestas en voladizos monocatenarios en los extremos del DSB. Por lo tanto, la reparación por MMEJ conduce a la eliminación de la secuencia de ADN entre las microhomologías.
En bacterias
Muchas especies de bacterias, incluida Escherichia coli , carecen de una vía de unión de extremos y, por lo tanto, dependen completamente de la recombinación homóloga para reparar las roturas de doble hebra. Sin embargo, se han identificado proteínas NHEJ en varias bacterias, incluidas Bacillus subtilis , Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium smegmatis . [8] [9] Las bacterias utilizan una versión notablemente compacta de NHEJ en la que todas las actividades requeridas están contenidas en solo dos proteínas: un homodímero Ku y la ligasa / polimerasa / nucleasa multifuncional LigD . [10] En las micobacterias, el NHEJ es mucho más propenso a errores que en la levadura, con bases a menudo agregadas y eliminadas de los extremos de las roturas de doble hebra durante la reparación. [9] Muchas de las bacterias que poseen proteínas NHEJ pasan una parte significativa de su ciclo de vida en una fase haploide estacionaria, en la que no se dispone de una plantilla para la recombinación. [8] El NHEJ puede haber evolucionado para ayudar a estos organismos a sobrevivir a los DSB inducidos durante la desecación. [11] Corndog y Omega, dos micobacteriófagos relacionados de Mycobacterium smegmatis , también codifican homólogos de Ku y explotan la vía NHEJ para recircularizar sus genomas durante la infección. [12] A diferencia de la recombinación homóloga , que se ha estudiado ampliamente en bacterias, el NHEJ se descubrió originalmente en eucariotas y solo se identificó en procariotas en la última década.
En eucariotas
A diferencia de las bacterias, NHEJ en eucariotas utiliza una serie de proteínas , que participan en los siguientes pasos:
Fin de la vinculación y el anclaje
En la levadura, el complejo Mre11-Rad50-Xrs2 ( MRX ) se recluta temprano en los DSB y se cree que promueve la unión de los extremos del ADN. [13] El complejo de mamíferos correspondiente de Mre11-Rad50- Nbs1 ( MRN ) también está involucrado en NHEJ, pero puede funcionar en múltiples pasos en la vía más allá de simplemente mantener los extremos en proximidad. [14] También se cree que DNA-PKcs participa en el puenteo de extremos durante el NHEJ de mamíferos. [15]
Ku eucariota es un heterodímero que consta de Ku70 y Ku80 , y forma un complejo con ADN-PKcs , que está presente en mamíferos pero ausente en levadura . Ku es una molécula en forma de cesta que se desliza hacia el extremo del ADN y se traslada hacia adentro. Ku puede funcionar como un sitio de acoplamiento para otras proteínas NHEJ y se sabe que interactúa con el complejo de ADN ligasa IV y XLF . [16] [17]
Procesamiento final
El procesamiento final implica la eliminación de nucleótidos dañados o mal emparejados por nucleasas y resíntesis por ADN polimerasas. Este paso no es necesario si los extremos ya son compatibles y tienen extremos 3 'hidroxilo y 5' fosfato.
Se sabe poco sobre la función de las nucleasas en NHEJ. Se requiere Artemis para abrir las horquillas que se forman en los extremos del ADN durante la recombinación V (D) J , un tipo específico de NHEJ, y también puede participar en el recorte de extremos durante el NHEJ general. [18] Mre11 tiene actividad nucleasa, pero parece estar involucrado en la recombinación homóloga , no en NHEJ.
Las ADN polimerasas de la familia X Pol λ y Pol μ (Pol4 en levadura ) llenan los huecos durante NHEJ. [3] [19] [20] La levadura que carece de Pol4 no puede unir voladizos de 3 'que requieren relleno de espacios, pero siguen siendo competentes para el llenado de espacios en voladizos de 5'. [21] Esto se debe a que el extremo del cebador utilizado para iniciar la síntesis de ADN es menos estable en los salientes 3 ', lo que requiere una polimerasa NHEJ especializada.
Ligadura
El complejo de ADN ligasa IV, que consiste en la subunidad catalítica ADN ligasa IV y su cofactor XRCC4 (Dnl4 y Lif1 en levadura), realiza el paso de reparación de ligadura. [22] XLF , también conocido como Cernunnos, es homólogo a la levadura Nej1 y también se requiere para NHEJ. [23] [24] Si bien se desconoce la función precisa de XLF , interactúa con el complejo XRCC4 / ADN ligasa IV y probablemente participa en el paso de ligadura. [25] Evidencia reciente sugiere que XLF promueve la re-adenilación de la ADN ligasa IV después de la ligadura, recargando la ligasa y permitiendo que catalice una segunda ligadura. [26]
Otro
En la levadura, Sir2 se identificó originalmente como una proteína NHEJ, pero ahora se sabe que es necesaria para NHEJ solo porque es necesaria para la transcripción de Nej1. [27]
Regulación
La elección entre NHEJ y recombinación homóloga para la reparación de una rotura de doble hebra se regula en el paso inicial de la recombinación, resección del extremo 5 '. En este paso, la hebra 5 'de la ruptura es degradada por nucleasas para crear largas colas monocatenarias 3'. Los DSB que no se han resecado pueden reunirse mediante NHEJ, pero la resección de incluso unos pocos nucleótidos inhibe fuertemente el NHEJ y compromete eficazmente la ruptura a reparar mediante recombinación. [20] El NHEJ está activo durante todo el ciclo celular, pero es más importante durante G1 cuando no se dispone de una plantilla homóloga para la recombinación. Esta regulación se logra mediante la quinasa dependiente de ciclina Cdk1 ( Cdc28 en levadura), que se apaga en G1 y se expresa en S y G2 . Cdk1 fosforila la nucleasa Sae2, lo que permite que se inicie la resección. [28]
V (D) J recombinación
NHEJ juega un papel crítico en V (D) J recombinación , el proceso por el cual las células B y células T del receptor se genera diversidad en el vertebrado sistema inmunológico . [29] En la recombinación V (D) J, la nucleasa RAG1 / RAG2 , que escinde el ADN en las secuencias señal de recombinación, crea roturas de doble hebra rematadas en horquilla . [30] Estas horquillas son luego abiertas por la nucleasa Artemis y unidas por NHEJ. [18] Una ADN polimerasa especializada llamada desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), que solo se expresa en el tejido linfático, agrega nucleótidos no moldeados a los extremos antes de que se unan las rupturas. [31] [32] Este proceso acopla las regiones "variable" (V), "diversidad" (D) y "uniendo" (J), que cuando se ensamblan juntas crean la región variable de un receptor de células B o T gene. A diferencia del NHEJ celular típico, en el que la reparación precisa es el resultado más favorable , la reparación propensa a errores en la recombinación V (D) J es beneficiosa porque maximiza la diversidad en la secuencia codificante de estos genes. Los pacientes con mutaciones en los genes NHEJ no pueden producir células B y células T funcionales y padecen inmunodeficiencia combinada grave (SCID).
En los telómeros
Los telómeros normalmente están protegidos por una "tapa" que evita que sean reconocidos como roturas de doble hebra. La pérdida de las proteínas de recubrimiento provoca un acortamiento de los telómeros y una unión inapropiada por parte del NHEJ, lo que produce cromosomas dicéntricos que luego se separan durante la mitosis. Paradójicamente, algunas proteínas NHEJ están involucradas en el recubrimiento de los telómeros. Por ejemplo, Ku se localiza en telómeros y su supresión conduce a telómeros acortados. [33] Ku también se requiere para el silenciamiento subtelomérico, el proceso por el cual los genes ubicados cerca de los telómeros se desactivan.
Consecuencias de la disfunción
Varios síndromes humanos están asociados con NHEJ disfuncional. [34] Las mutaciones hipomórficas en LIG4 y XLF causan el síndrome LIG4 y XLF-SCID, respectivamente. Estos síndromes comparten muchas características incluyendo radiosensibilidad celular, microcefalia y inmunodeficiencia combinada severa (SCID) debido a defectuoso V (D) J recombinación . Las mutaciones con pérdida de función en Artemis también causan SCID, pero estos pacientes no muestran los defectos neurológicos asociados con las mutaciones LIG4 o XLF. La diferencia de gravedad puede explicarse por las funciones de las proteínas mutadas. Artemis es una nucleasa y se cree que solo se requiere para la reparación de DSB con extremos dañados, mientras que la DNA Ligase IV y XLF son necesarias para todos los eventos NHEJ. Las mutaciones en genes que participan en la unión de extremos no homólogos conducen a ataxia-telangiectasia (gen ATM) , anemia de Fanconi (genes múltiples), así como cánceres hereditarios de mama y ovario (gen BRCA1).
Se han eliminado muchos genes NHEJ en ratones . La deleción de XRCC4 o LIG4 causa letalidad embrionaria en ratones, lo que indica que NHEJ es esencial para la viabilidad en mamíferos. Por el contrario, los ratones que carecen de Ku o DNA-PKcs son viables, probablemente porque aún pueden producirse niveles bajos de unión de extremos en ausencia de estos componentes. [35] Todos los ratones mutantes NHEJ muestran un fenotipo SCID, sensibilidad a la radiación ionizante y apoptosis neuronal.
Envejecimiento
Se desarrolló un sistema para medir la eficiencia de NHEJ en el ratón. [36] La eficiencia de NHEJ podría compararse en tejidos del mismo ratón y en ratones de diferentes edades. La eficiencia fue mayor en los fibroblastos de piel, pulmón y riñón, y menor en fibroblastos cardíacos y astrocitos cerebrales. Además, la eficiencia de NHEJ disminuyó con la edad. La disminución fue de 1.8 a 3.8 veces, dependiendo del tejido, en los ratones de 5 meses en comparación con los de 24 meses. La capacidad reducida para NHEJ puede conducir a un aumento en el número de roturas de doble hebra de ADN no reparadas o reparadas de manera defectuosa que luego pueden contribuir al envejecimiento. [37] (Véase también la teoría del envejecimiento del daño del ADN .) Un análisis del nivel de proteína NHEJ Ku80 en humanos, vacas y ratones indicó que los niveles de Ku80 varían drásticamente entre especies y que estos niveles están fuertemente correlacionados con la longevidad de las especies. [38]
Lista de proteínas involucradas en NHEJ en células humanas
- Ku70 / 80
- ADN-PKcs
- ADN ligasa IV
- XRCC4
- XLF
- Artemisa
- ADN polimerasa mu
- ADN polimerasa lambda
- PNKP
- Aprataxina
- APLF
- BRCA1
- BRCA2
- CYREN
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