La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa ( RT-PCR ) es una técnica de laboratorio que combina la transcripción inversa de ARN en ADN (en este contexto llamado ADN complementario o ADNc) y la amplificación de dianas de ADN específicas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). [1] Se utiliza principalmente para medir la cantidad de un ARN específico. Esto se logra monitoreando la reacción de amplificación usando fluorescencia, una técnica llamada PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR). La RT-PCR y la qPCR combinadas se utilizan habitualmente para el análisis de la expresión génica. y cuantificación del ARN viral en entornos clínicos y de investigación.
La estrecha asociación entre RT-PCR y qPCR ha llevado al uso metonímico del término qPCR para significar RT-PCR. Tal uso puede ser confuso, [2] ya que la RT-PCR se puede usar sin qPCR, por ejemplo, para permitir la clonación molecular , secuenciación o detección simple de ARN. Por el contrario, la qPCR se puede utilizar sin RT-PCR, por ejemplo, para cuantificar el número de copias de un fragmento específico de ADN.
Nomenclatura
La técnica combinada de RT-PCR y qPCR se ha descrito como RT-PCR cuantitativa [3] o RT-PCR en tiempo real [4] (a veces incluso llamada RT-PCR cuantitativa en tiempo real [5] ), se ha abreviado de diversas formas como qRT-PCR, [6] RT-qPCR, [7] RRT-PCR, [8] y rRT-PCR. [9] Para evitar confusiones, las siguientes abreviaturas se utilizarán de forma coherente a lo largo de este artículo:
Técnica | Abreviatura |
---|---|
Reacción en cadena de la polimerasa | PCR |
Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa | RT-PCR |
Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real | qPCR |
Técnica combinada RT-PCR / qPCR | qRT-PCR |
No todos los autores, especialmente los anteriores, utilizan esta convención y el lector debe tener cuidado al seguir los enlaces. La RT-PCR se ha utilizado para indicar tanto la PCR en tiempo real (qPCR) como la PCR de transcripción inversa (RT-PCR).
Historia
Desde su introducción en 1977, Northern blot se ha utilizado ampliamente para la cuantificación de ARN a pesar de sus deficiencias: (a) técnica que requiere mucho tiempo, (b) requiere una gran cantidad de ARN para la detección, y (c) cuantitativamente inexacta en la baja abundancia de Contenido de ARN. [10] [11] Sin embargo, desde su invención por Kary Mullis en 1983, la RT PCR ha desplazado a la transferencia Northern como el método de elección para la detección y cuantificación de ARN. [12]
La RT-PCR se ha convertido en la tecnología de referencia para la detección y / o comparación de los niveles de ARN por varias razones: (a) no requiere procesamiento posterior a la PCR, (b) una amplia gama (> 10 7 veces) de ARN la abundancia se puede medir y (c) proporciona información sobre datos tanto cualitativos como cuantitativos. [5] Debido a su simplicidad, especificidad y sensibilidad, la RT-PCR se utiliza en una amplia gama de aplicaciones, desde experimentos tan simples como la cuantificación de células de levadura en el vino hasta usos más complejos como herramientas de diagnóstico para detectar agentes infecciosos como la gripe aviar. virus y SARS-CoV-2 . [13] [14] [15]
Principios
En RT-PCR, la plantilla de ARN se convierte primero en un ADN complementario (ADNc) utilizando una transcriptasa inversa (RT). El ADNc se usa luego como molde para la amplificación exponencial usando PCR. QT- NASBA es actualmente el método más sensible de detección de ARN disponible. [16] [ cita irrelevante ] El uso de RT-PCR para la detección de la transcripción de ARN ha revolucionado el estudio de la expresión génica de las siguientes formas importantes:
- Teóricamente hizo posible detectar las transcripciones de prácticamente cualquier gen [17]
- Habilitó la amplificación de la muestra y eliminó la necesidad de abundante material de partida requerido cuando se usa el análisis de transferencia Northern [18] [19]
- Proporcionó tolerancia a la degradación del ARN siempre que el ARN que abarca el cebador esté intacto [18]
RT-PCR de un paso frente a RT-PCR de dos pasos
La cuantificación de ARNm mediante RT-PCR se puede lograr como una reacción de un paso o de dos pasos. La diferencia entre los dos enfoques radica en la cantidad de tubos utilizados al realizar el procedimiento. La reacción de dos pasos requiere que la reacción de transcriptasa inversa y la amplificación por PCR se realicen en tubos separados. La desventaja del enfoque de dos pasos es la susceptibilidad a la contaminación debido a una manipulación de muestras más frecuente. [20] Por otro lado, la reacción completa desde la síntesis de ADNc hasta la amplificación por PCR ocurre en un solo tubo en el enfoque de un solo paso. Se cree que el enfoque de un solo paso minimiza la variación experimental al contener todas las reacciones enzimáticas en un solo entorno. Elimina los pasos de pipetear el producto de ADNc, que requiere mucha mano de obra y es propenso a la contaminación, a la reacción de PCR. El uso adicional de polimerasas tolerantes a inhibidores, potenciadores de la polimerasa con una condición de RT-PCR optimizada en un solo paso, respalda la transcripción inversa del ARN de muestras crudas o no purificadas, como sangre total y suero . [21] [22] Sin embargo, las plantillas de ARN iniciales son propensas a degradarse en el enfoque de un solo paso, y no se recomienda el uso de este enfoque cuando se requieren ensayos repetidos de la misma muestra. Además, se informa que el enfoque de un paso es menos preciso en comparación con el enfoque de dos pasos. También es el método de análisis preferido cuando se utilizan tintes de unión al ADN como SYBR Green, ya que la eliminación de los dímeros de los cebadores se puede lograr mediante un simple cambio en la temperatura de fusión . No obstante, el enfoque de un solo paso es una solución relativamente conveniente para la detección rápida de ARN diana directamente en la biosensación. [ cita requerida ]
RT-PCR de punto final frente a RT-PCR en tiempo real
La cuantificación de los productos de RT-PCR se puede dividir en gran medida en dos categorías: punto final y tiempo real. [16] Se prefiere el uso de la RT-PCR de punto final para medir los cambios en la expresión génica en una pequeña cantidad de muestras, pero la RT-PCR en tiempo real se ha convertido en el método estándar de oro para validar los resultados cuantitativos obtenidos de los análisis de matriz o la expresión génica. cambios a escala global. [23]
RT-PCR de punto final
Los enfoques de medición de la RT-PCR de punto final requieren la detección de los niveles de expresión génica mediante el uso de tintes fluorescentes como el bromuro de etidio , [24] [25] etiquetado P32 de los productos de PCR mediante fosforimager , [26] o mediante recuento de centelleo . [19] La RT-PCR de punto final se logra comúnmente utilizando tres métodos diferentes: relativo, competitivo y comparativo. [27] [28]
- RT-PCR relativa
- Las cuantificaciones relativas de RT-PCR implican la coamplificación de un control interno simultáneamente con el gen de interés. El control interno se utiliza para normalizar las muestras. Una vez normalizado, se puede realizar una comparación directa de las abundancias relativas de transcripción en múltiples muestras de ARNm. Una precaución a tener en cuenta es que el control interno debe elegirse de manera que no se vea afectado por el tratamiento experimental. El nivel de expresión debe ser constante en todas las muestras y con el ARNm de interés para que los resultados sean precisos y significativos. Debido a que la cuantificación de los resultados se analiza comparando el rango lineal de la amplificación de control y la diana, es crucial tener en cuenta la concentración de moléculas diana iniciales y su tasa de amplificación antes de comenzar el análisis. Los resultados del análisis se expresan como las proporciones de la señal del gen a la señal de control interno, cuyos valores pueden usarse luego para la comparación entre las muestras en la estimación de la expresión relativa del ARN diana. [25] [28] [29]
- RT-PCR competitivo
- La técnica de RT-PCR competitiva se utiliza para la cuantificación absoluta. Implica el uso de un ARN "competidor" sintético que se puede distinguir del ARN objetivo por una pequeña diferencia de tamaño o secuencia. Es importante que el diseño del ARN sintético sea idéntico en secuencia pero ligeramente más corto que el ARN objetivo para obtener resultados precisos. Una vez diseñado y sintetizado, se agrega una cantidad conocida del ARN competidor a las muestras experimentales y se coamplifica con la diana mediante RT-PCR. Luego, se produce una curva de concentración del ARN competidor y se usa para comparar las señales de RT-PCR producidas a partir de las transcripciones endógenas para determinar la cantidad de diana presente en la muestra. [28] [30]
- RT-PCR comparativa
- La RT-PCR comparativa es similar a la RT-PCR competitiva en que el ARN diana compite por los reactivos de amplificación dentro de una sola reacción con un patrón interno de secuencia no relacionada. Una vez que se completa la reacción, los resultados se comparan con una curva estándar externa para determinar la concentración de ARN objetivo. En comparación con los métodos de cuantificación relativa y competitiva, se considera que la RT-PCR comparativa es el método más conveniente de usar ya que no requiere que el investigador realice un experimento piloto; en la RT-PCR relativa, el rango de amplificación exponencial del ARNm debe estar predeterminado y en la RT-PCR competitiva debe sintetizarse un ARN competidor sintético. [28] [31] [32] [33] [34]
RT-PCR en tiempo real
La aparición de nuevas técnicas de etiquetado de ADN fluorescente en los últimos años ha permitido el análisis y la detección de productos de PCR en tiempo real y, en consecuencia, ha llevado a la adopción generalizada de RT-PCR en tiempo real para el análisis de la expresión génica. La RT-PCR en tiempo real no solo es ahora el método de elección para la cuantificación de la expresión génica, sino que también es el método preferido para obtener resultados de análisis de matrices y expresiones génicas a escala global. Actualmente, hay cuatro sondas de ADN fluorescentes diferentes disponibles para la detección RT-PCR en tiempo real de productos de PCR: SYBR Green , TaqMan , balizas moleculares y sondas de escorpión . Todas estas sondas permiten la detección de productos de PCR al generar una señal fluorescente. Mientras que el tinte SYBR Green emite su señal fluorescente simplemente uniéndose al ADN de doble hebra en solución, la generación de fluorescencia de las sondas TaqMan, las balizas moleculares y los escorpiones depende del acoplamiento de la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) de la molécula del tinte y un resto extintor de los sustratos de oligonucleótidos. [35]
- SYBR Verde
- Cuando SYBR Green se une al ADN de doble hebra de los productos de PCR, emitirá luz al ser excitado. La intensidad de la fluorescencia aumenta a medida que se acumulan los productos de la PCR. Esta técnica es fácil de usar ya que el diseño de sondas no es necesario dada la falta de especificidad de su unión. Sin embargo, dado que el tinte no discrimina el ADN de doble hebra de los productos de la PCR y los de los dímeros de los cebadores, la sobreestimación de la concentración diana es un problema común. Cuando la cuantificación precisa sea una necesidad absoluta, se deben realizar más ensayos para la validación de los resultados. Sin embargo, entre los métodos de detección de productos RT-PCR en tiempo real, SYBR Green es el más económico y fácil de usar. [16] [23]
- Sondas TaqMan
- Las sondas TaqMan son oligonucleótidos que tienen una sonda fluorescente unida al extremo 5 'y un extintor al extremo 3'. Durante la amplificación por PCR, estas sondas se hibridarán con las secuencias diana ubicadas en el amplicón y, a medida que la polimerasa replica el molde con TaqMan unido, también escinde la sonda fluorescente debido a la actividad de la polimerasa 5'-nucleasa. Debido a que la estrecha proximidad entre la molécula de extinción y la sonda fluorescente normalmente evita que se detecte la fluorescencia a través de FRET, el desacoplamiento da como resultado un aumento de la intensidad de la fluorescencia proporcional al número de ciclos de escisión de la sonda. Aunque las sondas TaqMan bien diseñadas producen resultados precisos de RT-PCR en tiempo real, es costoso y requiere mucho tiempo sintetizar cuando se deben hacer sondas separadas para cada objetivo de ARNm analizado. [16] [17] [36] Además, estas sondas son sensibles a la luz y deben congelarse cuidadosamente como alícuotas para evitar la degradación.
- Sondas de baliza molecular
- De forma similar a las sondas TaqMan, las balizas moleculares también utilizan la detección FRET con sondas fluorescentes unidas al extremo 5 'y un extintor unido al extremo 3' de un sustrato oligonucleotídico. Sin embargo, mientras que las sondas fluorescentes TaqMan se escinden durante la amplificación, las sondas de baliza molecular permanecen intactas y se vuelven a unir a una nueva diana durante cada ciclo de reacción. Cuando está libre en solución, la proximidad de la sonda fluorescente y la molécula extintor evita la fluorescencia a través de FRET. Sin embargo, cuando las sondas de baliza molecular se hibridan con una diana, el tinte fluorescente y el extintor se separan dando como resultado la emisión de luz tras la excitación. Al igual que con las sondas TaqMan, las balizas moleculares son caras de sintetizar y requieren sondas separadas para cada objetivo de ARN. [20]
- Sondas de escorpión
- Las sondas de escorpión, como las balizas moleculares, no serán fluorescentes activas en un estado no hibridado, nuevamente, debido a que la sonda fluorescente en el extremo 5 'se apaga por el resto en el extremo 3' de un oligonucleótido. Con Scorpions, sin embargo, el extremo 3 'también contiene una secuencia que es complementaria al producto de extensión del cebador en el extremo 5'. Cuando la extensión Scorpion se une a su complemento en el amplicón, la estructura Scorpion se abre, evita FRET y permite medir la señal fluorescente. [37]
- Sondas multiplex
- Las sondas TaqMan, balizas moleculares y escorpiones permiten la medición simultánea de productos de PCR en un solo tubo. Esto es posible porque cada uno de los diferentes tintes fluorescentes puede asociarse con un espectro de emisión específico. El uso de sondas multiplex no solo ahorra tiempo y esfuerzo sin comprometer la utilidad de la prueba, sino que su aplicación en amplias áreas de investigación, como el análisis de deleción de genes, el análisis de mutaciones y polimorfismos, el análisis cuantitativo y la detección de ARN, la convierten en una técnica invaluable para los laboratorios de mucha disciplina. [37] [38] [39]
Se emplean comúnmente dos estrategias para cuantificar los resultados obtenidos por RT-PCR en tiempo real; el método de la curva estándar y el método de umbral comparativo. [40]
Solicitud
La amplificación exponencial mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa proporciona una técnica muy sensible en la que se puede detectar un número muy bajo de copias de moléculas de ARN. La RT-PCR se usa ampliamente en el diagnóstico de enfermedades genéticas y, semicuantitativamente, en la determinación de la abundancia de diferentes moléculas de ARN específicas dentro de una célula o tejido como medida de expresión génica .
Métodos de búsqueda
La RT-PCR se usa comúnmente en métodos de investigación para medir la expresión génica. Por ejemplo, Lin et al. utilizaron qRT-PCR para medir la expresión de genes Gal en células de levadura. Primero, Lin et al. diseñó una mutación de una proteína que se sospecha participa en la regulación de los genes Gal. Se planteó la hipótesis de que esta mutación abolía selectivamente la expresión de Gal. Para confirmar esto, los niveles de expresión génica de las células de levadura que contienen esta mutación se analizaron usando qRT-PCR. Los investigadores pudieron determinar de manera concluyente que la mutación de esta proteína reguladora reducía la expresión de Gal. [41] El análisis de transferencia Northern se utiliza para estudiar más a fondo la expresión génica del ARN.
Inserción de genes
La RT-PCR también puede ser muy útil en la inserción de genes eucariotas en procariotas . Debido a que la mayoría de los genes eucariotas contienen intrones , que están presentes en el genoma pero no en el ARNm maduro, el ADNc generado a partir de una reacción de RT-PCR es la secuencia de ADN exacta (sin tener en cuenta la naturaleza propensa a errores de las transcriptasas inversas) que sería traducido directamente en proteína después de la transcripción . Cuando estos genes se expresan en células procariotas con el fin de la producción o purificación de proteínas, el ARN producido directamente a partir de la transcripción no necesita someterse a empalme ya que la transcripción contiene solo exones . (Los procariotas, como E. coli, carecen del mecanismo de empalme de ARNm de los eucariotas).
Diagnóstico de enfermedades genéticas
La RT-PCR se puede utilizar para diagnosticar enfermedades genéticas como el síndrome de Lesch-Nyhan . Esta enfermedad genética es causada por un mal funcionamiento en el gen HPRT1 , que clínicamente conduce a la piedra urinaria de ácido úrico fatal y síntomas similares a la gota . [6] [ aclaración necesaria ] El análisis de una madre embarazada y un feto para los niveles de expresión de ARNm de HPRT1 revelará si la madre es portadora y si es probable que el feto desarrolle el síndrome de Lesch-Nyhan. [42]
Detección de cáncer
Los científicos están trabajando en formas de utilizar RT-PCR en la detección del cáncer para ayudar a mejorar el pronóstico y monitorear la respuesta a la terapia. Las células tumorales circulantes producen transcripciones de ARNm únicas según el tipo de cáncer. El objetivo es determinar qué transcripciones de ARNm sirven como los mejores biomarcadores para un tipo de célula cancerosa en particular y luego analizar sus niveles de expresión con RT-PCR. [43]
La RT-PCR se usa comúnmente para estudiar los genomas de virus cuyos genomas están compuestos de ARN, como el Influenzavirus A , retrovirus como el VIH y el SARS-CoV-2 . [44]
Desafíos
A pesar de sus principales ventajas, la RT-PCR no está exenta de inconvenientes. El crecimiento exponencial del ADN complementario de transcripción inversa (ADNc) durante los múltiples ciclos de PCR produce una cuantificación del punto final inexacta debido a la dificultad de mantener la linealidad. [45] Con el fin de proporcionar una detección y cuantificación precisas del contenido de ARN en una muestra, se desarrolló qRT-PCR utilizando una modificación basada en fluorescencia para monitorear los productos de amplificación durante cada ciclo de PCR. La extrema sensibilidad de la técnica puede ser un arma de doble filo, ya que incluso la más mínima contaminación de ADN puede dar lugar a resultados no deseados. [46] Un método simple para eliminar los resultados falsos positivos es incluir anclajes, o etiquetas , en la región 5 'de un cebador específico de un gen. [47] Además, la planificación y el diseño de estudios de cuantificación pueden resultar técnicamente desafiantes debido a la existencia de numerosas fuentes de variación, incluida la concentración de la plantilla y la eficiencia de amplificación. [31] Agregar una cantidad conocida de ARN en una muestra, agregar una serie de diluciones de ARN generando una curva estándar y agregar una muestra sin copia de plantilla (sin ADNc) puede usarse como controles.
Protocolo
La RT-PCR se puede llevar a cabo mediante el protocolo RT-PCR de un paso o el protocolo RT-PCR de dos pasos.
RT-PCR de un solo paso
La RT-PCR de un solo paso somete a los objetivos de ARNm (hasta 6 kb) a la transcripción inversa seguida de la amplificación por PCR en un solo tubo de ensayo. Es importante tener en cuenta que el uso de ARN intacto de alta calidad y un cebador específico de secuencia producirá los mejores resultados.
Una vez que se selecciona un kit de RT-PCR de un solo paso con una mezcla de transcriptasa inversa, ADN polimerasa Taq y una polimerasa de corrección y se obtienen todos los materiales y equipos necesarios, se debe preparar una mezcla de reacción. La mezcla de reacción incluye dNTP, cebadores, plantilla de ARN, enzimas necesarias y una solución tampón. La mezcla de reacción se agrega a un tubo de PCR para cada reacción, seguida de la plantilla de ARN. Luego, los tubos de PCR se colocan en un termociclador para comenzar a ciclar. En el primer ciclo, se produce la síntesis de ADNc. El segundo ciclo es la desnaturalización inicial en la que se inactiva la transcriptasa inversa. Los 40-50 ciclos restantes son la amplificación, que incluye desnaturalización, hibridación y alargamiento. Cuando se completa la amplificación, los productos de RT-PCR se pueden analizar con electroforesis en gel . [48] [49]
(Manual de aplicaciones de PCR y Biotools)
RT-PCR de dos pasos
La RT-PCR de dos pasos, como su nombre lo indica, se produce en dos pasos. Primero la transcripción inversa y luego la PCR. Este método es más sensible que el método de un solo paso. Los kits también son útiles para RT-PCR de dos pasos. Al igual que para la PCR de un paso, utilice solo ARN intacto de alta calidad para obtener los mejores resultados. El cebador para la PCR de dos pasos no tiene que ser específico de secuencia.
Paso uno
Primero combine el ARN de plantilla, el cebador, la mezcla de dNTP y el agua libre de nucleasas en un tubo de PCR. Luego, agregue un inhibidor de RNasa y transcriptasa inversa al tubo de PCR. A continuación, coloque el tubo de PCR en un termociclador durante un ciclo en el que
se produce el recocido, la extensión y la inactivación de la transcriptasa inversa. Finalmente, proceda directamente al paso dos que es PCR o almacene el producto en hielo hasta que se pueda realizar la PCR.
Segundo paso
Agregue la mezcla maestra que contiene tampón, mezcla de dNTP, MgCl 2 , polimerasa Taq y agua libre de nucleasas a cada tubo de PCR. Luego agregue la imprimación necesaria a los tubos. A continuación, coloque los tubos de PCR en un termociclador durante 30 ciclos del programa de amplificación. Esto incluye: desnaturalización, recocido y alargamiento. Los productos de RT-PCR se pueden analizar con electroforesis en gel. [50]
Pautas de publicación
El ensayo de RT-PCR cuantitativa se considera el estándar de oro para medir el número de copias de dianas de ADNc específicas en una muestra, pero está mal estandarizado. [51] Como resultado, aunque existen numerosas publicaciones que utilizan la técnica, muchas proporcionan detalles experimentales inadecuados y utilizan análisis de datos inadecuados para sacar conclusiones inapropiadas. Debido a la variabilidad inherente en la calidad de cualquier dato de PCR cuantitativo, los revisores no solo tienen dificultades para evaluar estos manuscritos, sino que los estudios también se vuelven imposibles de replicar. [52] Reconociendo la necesidad de estandarizar la notificación de condiciones experimentales, un consorcio internacional de científicos académicos ha publicado las directrices de Información mínima para la publicación de experimentos cuantitativos en tiempo real de PCR (MIQE, pronunciado mykee). Las pautas de MIQE describen la información mínima necesaria para evaluar los experimentos de PCR cuantitativos que se deben solicitar para su publicación para fomentar una mejor práctica experimental y garantizar la relevancia, precisión, interpretación correcta y repetibilidad de los datos de PCR cuantitativos. [53]
Además de las directrices para la presentación de informes, el MIQE destaca la necesidad de estandarizar la nomenclatura asociada con la PCR cuantitativa para evitar confusiones; por ejemplo, la abreviatura qPCR debe usarse para PCR cuantitativa en tiempo real y RT-qPCR debe usarse para transcripción inversa-qPCR , y los genes usados para normalización deben denominarse genes de referencia en lugar de genes internos . También propone que no se utilicen términos derivados comercialmente como sondas TaqMan, sino que se denominen sondas de hidrólisis . Además, se propone que el ciclo de cuantificación (Cq) se utilice para describir el ciclo de PCR utilizado para la cuantificación en lugar del ciclo de umbral (Ct), el punto de cruce (Cp) y el punto de despegue (TOP), que se refieren al mismo valor pero fueron acuñado por diferentes fabricantes de instrumentos en tiempo real . [51]
La guía consta de los siguientes elementos: 1) diseño experimental, 2) muestra, 3) extracción de ácido nucleico, 4) transcripción inversa, 5) información del objetivo de qPCR, 6) oligonucleótidos, 7) protocolo, 8) validación y 9) datos análisis. Los artículos específicos dentro de cada elemento llevan una etiqueta de E (esencial) o D (deseable). Los etiquetados con E se consideran críticos e indispensables, mientras que los etiquetados con D se consideran periféricos pero importantes para las mejores prácticas. [53]
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enlaces externos
- Protocolos de RT-PCR de Penn State University
- Base de datos de juegos de cebadores de PCR validados ( crítica del sitio web )
- Animación para ilustrar el procedimiento de RT-PCR, de Cold Spring Harbor Laboratory
- La referencia en qPCR: una plataforma de información académica e industrial