Voltamperometría de película de proteína

En electroquímica , la voltamperometría de película de proteína (o electroquímica de película de proteína , o electroquímica directa de proteínas ) es una técnica para examinar el comportamiento de proteínas inmovilizadas ( adsorbidas o unidas covalentemente) en un electrodo . La técnica es aplicable a proteínas y enzimas que participan en reacciones de transferencia de electrones y forma parte de los métodos disponibles para estudiar la cinética enzimática .

Siempre que haga un contacto adecuado con la superficie del electrodo (la transferencia de electrones entre el electrodo y la proteína es directa) y siempre que no esté desnaturalizada , la proteína puede interrogarse de manera fructífera controlando la corriente en función del potencial del electrodo y otros parámetros experimentales.

Se pueden utilizar varios materiales de electrodos. ^[1] Se requieren diseños de electrodos especiales para abordar las proteínas unidas a la membrana. ^[2]

Experimentos con proteínas redox

Las proteínas redox pequeñas, como los citocromos y las ferredoxinas, pueden investigarse con la condición de que su cobertura electroactiva (la cantidad de proteína sometida a transferencia directa de electrones) sea lo suficientemente grande (en la práctica, mayor que una fracción de pmol / cm ² ).

Los datos electroquímicos obtenidos con proteínas pequeñas se pueden utilizar para medir los potenciales redox de los sitios redox de la proteína, ^[3] la tasa de transferencia de electrones entre la proteína y el electrodo, ^[4] o las tasas de reacciones químicas (como las protonaciones) que están acoplados a la transferencia de electrones. ^[5]

Interpretación de la corriente máxima y el área de la cresta

Fig. 1. Señales voltamétricas para una especie redox de un electrón (A) o dos electrones (B) adsorbidos en un electrodo en el límite de la velocidad de barrido lenta. La corriente trazada aquí está normalizada por${\displaystyle F^{2}\nu A\Gamma /RT}$, lo que implica que la corriente medida aumenta en proporción a la velocidad de exploración (${\displaystyle \nu }$).

Fig 2. Efecto de la velocidad de barrido en la voltamperometría de una especie redox de un electrón adsorbida en un electrodo (la corriente que se muestra aquí está normalizada por ${\displaystyle F^{2}\nu A\Gamma /RT}$, lo que implica que la corriente medida aumenta en proporción a la velocidad de exploración (${\displaystyle \nu }$)) calculado para ${\displaystyle \alpha =0.5}$, ${\displaystyle T=298}$K. La frecuencia de exploración aumenta de azul a rojo. A: voltamogramas. B: potenciales máximos

En un experimento de voltamperometría cíclica realizado con una proteína redox adsorbida, la oxidación y reducción de cada sitio redox se muestra como un par de picos positivos y negativos. Dado que toda la muestra se oxida o se reduce durante el barrido potencial, la corriente máxima y el área máxima deben ser proporcionales a la velocidad de exploración (observar que la corriente máxima es proporcional a la velocidad de exploración demuestra que la especie redox que produce el pico está realmente inmovilizada). ^[3] Lo mismo ocurre con los experimentos realizados con moléculas redox no biológicas adsorbidas en electrodos. La teoría fue desarrollada principalmente por el francés Etienne electroquímico Laviron en la década de 1980 ^{[4] , [6] ,} . ^[7]

Dado que tanto esta corriente faradaica (que resulta de la oxidación / reducción de la molécula adsorbida) como la corriente capacitiva (que resulta de la carga del electrodo) aumentan en proporción a la velocidad de exploración, los picos deben permanecer visibles cuando la velocidad de exploración aumenta. Por el contrario, cuando el analito redox está en solución y se difunde hacia / desde el electrodo, la corriente máxima es proporcional a la raíz cuadrada de la velocidad de exploración (ver: ecuación de Randles-Sevcik ).

Área de pico

Independientemente de la velocidad de exploración, el área debajo del pico (en unidades de AV) es igual a ${\displaystyle nFA\Gamma \nu }$, donde ${\displaystyle n}$ es el número de electrones intercambiados en la oxidación / reducción del centro, ${\displaystyle A}$ es la superficie del electrodo y ${\displaystyle \Gamma }$es la cobertura electroactiva (en unidades de mol / cm ² ). ^[3] Por lo tanto, este último se puede deducir del área bajo el pico después de restar la corriente capacitiva .

Forma de pico

Velocidad de escaneo lenta

A velocidades de exploración lentas, no debería haber separación entre los picos oxidativos y reductores.

• Un sitio de un electrón (por ejemplo, un grupo hemo o FeS) da un pico ancho (figura 1A). La ecuación que da la forma e intensidad del pico es:

${\displaystyle {\frac {i}{F^{2}\nu A\Gamma /RT}}=\pm {\frac {\exp \left({\frac {F}{RT}}(E-E^{0})\right)}{(1+\exp \left({\frac {F}{RT}}(E-E^{0})\right)^{2}}}}$

Idealmente, la posición pico es ${\displaystyle E_{p}=E^{0}}$en ambas direcciones. La corriente máxima es${\displaystyle i_{p}=F^{2}\nu A\Gamma /4RT}$ (es proporcional a la velocidad de escaneo, ${\displaystyle \nu }$, y a la cantidad de sitios redox en el electrodo, ${\displaystyle A\Gamma }$). La mitad ideal de ancho a mitad de altura (HWHH) equivale${\displaystyle RT/F\times \ln(3+2{\sqrt {2}})=89}$mV a 20 ° C. El comportamiento no ideal puede resultar en que el pico sea más amplio que el límite ideal.

• La forma del pico para un sitio redox de dos electrones (por ejemplo, una flavina ) depende de la estabilidad del estado semi-reducido (figura 1B). Si el estado semi-reducido es estable en un amplio rango de potencial de electrodo, la señal es la suma de dos picos de un electrón (línea púrpura en la figura 1B). Si el estado medio reducido es inestable, la señal es un solo pico (línea roja en la figura 1B), que puede tener hasta cuatro veces la altura y la mitad del ancho de un pico de un electrón. ^{[6] , [8]}
• Una proteína que contiene múltiples centros redox debe dar múltiples picos que tienen todos la misma área (escalados por ${\displaystyle n}$).

Velocidades de escaneo rápidas

Si la reacción es una simple reacción de transferencia de electrones, los picos deben permanecer simétricos a velocidades de barrido rápidas. Se observa una separación de picos cuando la velocidad de escaneo${\displaystyle \nu \gg RTk^{0}/F}$, donde ${\displaystyle k_{0}}$es la constante de tasa de transferencia de electrones de intercambio en la teoría de Butler Volmer . La ecuación de Laviron ^{[4] , [8] , [9]} predice que a velocidades de barrido rápidas, los picos se separan en proporción a${\displaystyle \log(\nu /k^{0})}$. El mas largo${\displaystyle \nu }$ o el mas pequeño ${\displaystyle k^{0}}$, mayor es la separación de picos. Los potenciales máximos son${\displaystyle E_{p}=E^{0}\pm {\frac {RT}{\alpha F}}\ln {\frac {\alpha F\nu }{k^{0}RT}}}$, ^[4] como se muestra en las líneas de la figura 2B (${\displaystyle \alpha }$es el coeficiente de transferencia de carga ). Examinar el cambio experimental en la posición del pico frente a la tasa de exploración, por lo tanto, informa sobre la tasa de transferencia de electrones interfaciales.${\displaystyle k^{0}}$.

Efecto de reacciones químicas acopladas

Las reacciones acopladas son reacciones cuya velocidad o constante de equilibrio no es la misma para las formas oxidadas y reducidas de la especie que se está investigando. Por ejemplo, la reducción debería favorecer la protonación (${\displaystyle pK_{a}^{\rm {ox}}<pK_{a}^{\rm {red}}}$): la reacción de protonación se acopla a la reducción en ${\displaystyle pK_{a}^{\rm {ox}}<pH<pK_{a}^{\rm {red}}}$. La unión de una molécula pequeña (distinta del protón) también se puede acoplar a una reacción redox.

Se deben considerar dos casos dependiendo de si la reacción acoplada es lenta o rápida (lo que significa que la escala de tiempo de la reacción acoplada es mayor o menor que la escala de tiempo voltamétrica ^[10]). ${\displaystyle \tau =RT/F\nu }$).

• Las reacciones químicas rápidas que se acoplan a la transferencia de electrones (como la protonación) solo afectan los valores aparentes de${\displaystyle E^{0}}$ y ${\displaystyle k^{0}}$, ^[7] pero los picos permanecen simétricos. La dependencia de${\displaystyle E^{0}}$ en la concentración de ligando (por ejemplo, la dependencia de ${\displaystyle E^{0}}$sobre el pH representado en un diagrama de Pourbaix ) se puede interpretar para obtener las constantes de disociación (por ejemplo, constantes de acidez ) de las formas oxidadas o reducidas de las especies redox.
• La asimetría puede ser resultado de lentas reacciones químicas que están acopladas a (y puerta de la transferencia de electrones). A partir de la voltamperometría de barrido rápido, se puede obtener información sobre las velocidades de las reacciones que se acoplan a la transferencia de electrones. El caso de${\displaystyle n=1}$ y ${\displaystyle n=2}$Las reacciones electroquímicas de superficie reversibles seguidas de reacciones químicas irreversibles fueron abordadas por Laviron en las referencias ^{[6] , [11]} pero los datos generalmente se interpretan usando la solución numérica de las ecuaciones diferenciales apropiadas. ^[9]

Experimentos con enzimas redox

En estudios de enzimas , la corriente resulta de la oxidación o reducción catalítica del sustrato de la enzima .

La cobertura electroactiva de grandes enzimas redox (como lacasa , hidrogenasa , etc.) es a menudo demasiado baja para detectar cualquier señal en ausencia de sustrato, pero la señal electroquímica se amplifica por catálisis: de hecho, la corriente catalítica es proporcional a los tiempos de rotación. Cobertura electroactiva. Se puede examinar el efecto de variar el potencial del electrodo, el pH o la concentración de sustratos e inhibidores, etc. para conocer varios pasos del mecanismo catalítico. ^[8]

Interpretación del valor de la corriente catalítica

Para una enzima inmovilizada en un electrodo, el valor de la corriente a un cierto potencial equivale ${\displaystyle \pm nFA\Gamma \times {\rm {TOF}}}$, donde ${\displaystyle n}$ es el número de electrones intercambiados en la reacción catalítica, ${\displaystyle A}$ es la superficie del electrodo, ${\displaystyle \Gamma }$es la cobertura electroactiva y TOF es la frecuencia de rotación (o "número de rotación") , es decir, el número de moléculas de sustrato transformadas por segundo y por molécula de enzima adsorbida). Este último se puede deducir del valor absoluto de la corriente solo con la condición de que${\displaystyle A\Gamma }$se conoce, que rara vez es el caso. Sin embargo, la información se obtiene analizando el cambio relativo en la corriente que resulta de cambiar las condiciones experimentales.

Los factores que pueden influir en el TOF son (i) el transporte de masa del sustrato hacia el electrodo donde se inmoviliza la enzima ( difusión y convección ), (ii) la tasa de transferencia de electrones entre el electrodo y la enzima (transferencia de electrones interfacial), y (iii) la actividad "intrínseca" de la enzima, todo lo cual puede depender del potencial del electrodo.

La enzima a menudo se inmoviliza en un electrodo de trabajo de disco giratorio (RDE) que se hace girar rápidamente para evitar el agotamiento del sustrato cerca del electrodo. En ese caso, el transporte de masa de sustrato hacia el electrodo donde se adsorbe la enzima puede no influir.

Respuesta voltamétrica de estado estacionario

En condiciones muy oxidantes o muy reductoras, la corriente catalítica en estado estacionario a veces tiende a un valor límite (una meseta) que (siempre que no haya limitación de transporte de masa) se relaciona con la actividad de la enzima completamente oxidada o completamente reducida, respectivamente. Si la transferencia de electrones interfacial es lenta y si hay una distribución de velocidades de transferencia de electrones (resultante de una distribución de orientaciones de las moléculas de enzimas en el electrodo), la corriente sigue aumentando linealmente con el potencial en lugar de alcanzar una meseta; en ese caso, la pendiente límite es proporcional a la tasa de renovación de la enzima completamente oxidada o completamente reducida. ^[8]

El cambio en la corriente de estado estable frente al potencial es a menudo complejo (por ejemplo, no meramente sigmoidal). ^[12]

Salida del estado estable

Otro nivel de complejidad proviene de la existencia de reacciones lentas impulsadas por redox que pueden cambiar la actividad de la enzima y hacer que la respuesta se aparte del estado estable. ^[13] Aquí, lento significa que la escala de tiempo de la (in) activación es similar a la escala de tiempo voltamétrica ^[10] ${\displaystyle \tau =RT/F\nu }$. Si se utiliza un RDE , estas (in) activaciones lentas se detectan mediante una histéresis en el voltamograma catalítico que no se debe al transporte de masa. La histéresis puede desaparecer a velocidades de exploración muy rápidas (si la inactivación no tiene tiempo para continuar) o a velocidades de exploración muy lentas (si la reacción de (in) activación alcanza un estado estable). ^[14]

Combinando voltamperometría y espectroscopia de película de proteína

La voltamperometría convencional ofrece una imagen limitada de la interfaz enzima-electrodo y de la estructura de las especies involucradas en la reacción. Complementar la electroquímica estándar con otros métodos puede proporcionar una imagen más completa de la catálisis. ^{[15] [16] [17]}

Referencias

1. Jeuken, Lars JC (2016). "Estructura y modificación de materiales de electrodos para electroquímica de proteínas". Biofotoelectroquímica: de la bioelectroquímica a la biofotovoltaica . Avances en Ingeniería Bioquímica / Biotecnología. 158 . Springer, Cham. págs. 43–73. doi : 10.1007 / 10_2015_5011 . ISBN 9783319506654. PMID  27506830 .
2. Jeuken, Lars JC (23 de septiembre de 2009). "Electrodos para enzimas integrales de membrana". Informes de productos naturales . 26 (10): 1234–40. doi : 10.1039 / b903252e . ISSN 1460-4752 . PMID 19779638 .  
3. Bard, Allen J. (2001). Métodos electroquímicos: fundamentos y aplicaciones . Faulkner, Larry R., 1944- (2ª ed.). Nueva York: Wiley. ISBN 9780471043720. OCLC  43859504 .
4. Laviron, E. (1979). "Expresión general del voltamograma de barrido de potencial lineal en el caso de sistemas electroquímicos sin difusión". Revista de Química Electroanalítica y Electroquímica Interfacial . 101 (1): 19-28. doi : 10.1016 / s0022-0728 (79) 80075-3 .
5. Chen, Kaisheng; Hirst, Judy; Camba, Raúl; Bonagura, Christopher A .; Stout, C. David; Burgess, Barbara. K .; Armstrong, Fraser A. (15 de junio de 2000). "Mecanismo definido atómicamente para la transferencia de protones a un centro redox enterrado en una proteína". Naturaleza . 405 (6788): 814–817. doi : 10.1038 / 35015610 . ISSN 1476-4687 . PMID 10866206 .  
6. Plichon, V .; Laviron, E. (1976). "Estudio teórico de una reacción electroquímica reversible de dos pasos asociada con reacciones químicas irreversibles en voltamperometría de barrido de potencial lineal de capa fina". Revista de Química Electroanalítica y Electroquímica Interfacial . 71 (2): 143-156. doi : 10.1016 / s0022-0728 (76) 80030-7 .
7. Laviron, E. (1980). "Estudio teórico de una reacción electroquímica de superficie 1e, 1H + (esquema cuadrado de cuatro miembros) cuando las reacciones de protonación están en equilibrio". Revista de Química Electroanalítica y Electroquímica Interfacial . 109 (1-3): 57-67. doi : 10.1016 / s0022-0728 (80) 80106-9 .
8. Léger, Christophe; Bertrand, Patrick (1 de julio de 2008). "Electroquímica directa de enzimas redox como herramienta para estudios mecanicistas" (PDF) . Revisiones químicas . 108 (7): 2379–2438. doi : 10.1021 / cr0680742 . ISSN 0009-2665 . PMID 18620368 .   
9. Armstrong, Fraser A .; Camba, Raúl; Heering, Hendrik A .; Hirst, Judy; Jeuken, Lars JC; Jones, Anne K .; Le′ger, Christophe; McEvoy, James P. (1 de enero de 2000). "Estudios voltamperométricos rápidos de la cinética y energética de reacciones acopladas de transferencia de electrones en proteínas". Discusiones de Faraday . 116 (116): 191-203. Código bibliográfico : 2000FaDi..116..191A . doi : 10.1039 / b002290j . ISSN 1364-5498 . PMID 11197478 .  
10. Savéant, Jean-Michel (2006), Elementos de la electroquímica molecular y biomolecular: un enfoque electroquímico de la química de transferencia de electrones , John Wiley & Sons , p. 455, doi : 10.1002 / 0471758078 , ISBN 978-0-471-44573-9
11. Laviron, E. (1972). "Influencia de la adsorción del despolarizador o de un producto de la reacción electroquímica sobre corrientes polarográficas". Revista de Química Electroanalítica y Electroquímica Interfacial . 35 (1): 333–342. doi : 10.1016 / s0022-0728 (72) 80318-8 .
12. Elliott, Sean J; Léger, Christophe; Pershad, Harsh R; Hirst, Judy; Heffron, Kerensa; Ginet, Nicolás; Blasco, Francis; Rothery, Richard A; Weiner, Joel H; Armstrong, Fraser (2002). "Detección e interpretación de potenciales redox óptimos en la actividad catalítica de enzimas" . Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergética . 1555 (1-3): 54–59. doi : 10.1016 / s0005-2728 (02) 00254-2 . PMID 12206891 . 
13. Fourmond, Vincent; Léger, Christophe (2017). "Modelado de la voltamperometría de enzimas adsorbidas y catalizadores moleculares" (PDF) . Opinión Actual en Electroquímica . 1 (1): 110–120. doi : 10.1016 / j.coelec.2016.11.002 .
14. del Barrio, Melisa; Sensi, Matteo; Orain, Christophe; Baffert, Carole; Dementin, Sébastien; Fourmond, Vincent; Léger, Christophe (2018). "Investigaciones electroquímicas de hidrogenasas y otras enzimas que producen y utilizan combustibles solares" (PDF) . Cuentas de Investigación Química . 51 (3): 769–777. doi : 10.1021 / acs.accounts.7b00622 . ISSN 0001-4842 . PMID 29517230 .   
15. Murgida, Daniel H .; Hildebrandt, Peter (2005). "Procesos redox y redox acoplados de proteínas hemo y enzimas en interfaces electroquímicas". Física Química Física Química . 7 (22): 3773–84. Código Bibliográfico : 2005PCCP .... 7.3773M . doi : 10.1039 / b507989f . ISSN 1463-9084 . PMID 16358026 .  
16. Ash, Philip A .; Vincent, Kylie A. (2016). Biofotoelectroquímica: de la bioelectroquímica a la biofotovoltaica . Avances en Ingeniería Bioquímica / Biotecnología. 158 . Springer, Cham. págs. 75-110. doi : 10.1007 / 10_2016_3 . ISBN 9783319506654. PMID  27475648 .
17. Kornienko, Nikolay; Ly, Khoa H .; Robinson, William E .; Heidary, Nina; Zhang, Jenny Z .; Reisner, Erwin (1 de mayo de 2019). "Técnicas avanzadas para investigar la interfaz enzima-electrodo" . Cuentas de Investigación Química . 52 (5): 1439–1448. doi : 10.1021 / acs.accounts.9b00087 . ISSN 0001-4842 . PMC 6533600 . PMID 31042353 .