inmunoprecipitación
La inmunoprecipitación ( IP ) es la técnica de precipitar un antígeno proteico fuera de la solución utilizando un anticuerpo que se une específicamente a esa proteína en particular. Este proceso se puede utilizar para aislar y concentrar una proteína particular de una muestra que contiene muchos miles de proteínas diferentes. La inmunoprecipitación requiere que el anticuerpo se acople a un sustrato sólido en algún momento del procedimiento.
Implica el uso de un anticuerpo que es específico para una proteína conocida para aislar esa proteína en particular de una solución que contiene muchas proteínas diferentes. Estas soluciones estarán a menudo en forma de un lisado crudo de un tejido vegetal o animal. Otros tipos de muestras podrían ser fluidos corporales u otras muestras de origen biológico.
La inmunoprecipitación de complejos proteicos intactos (es decir, antígeno junto con cualquier proteína o ligando que esté unido a él) se conoce como coinmunoprecipitación (Co-IP). Co-IP funciona seleccionando un anticuerpo que se dirige a una proteína conocida que se cree que es miembro de un complejo más grande de proteínas. Al apuntar a este miembro conocido con un anticuerpo, puede ser posible extraer todo el complejo proteico de la solución y, por lo tanto, identificar miembros desconocidos del complejo.
Esto funciona cuando las proteínas involucradas en el complejo se unen entre sí con fuerza, lo que hace posible sacar de la solución varios miembros del complejo uniéndose a un miembro con un anticuerpo. Este concepto de extraer los complejos de proteínas de la solución a veces se denomina "extracción". Co-IP es una técnica poderosa que los biólogos moleculares utilizan regularmente para analizar las interacciones proteína-proteína .
La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un método utilizado para determinar la ubicación de los sitios de unión al ADN en el genoma para una proteína de interés en particular. Esta técnica brinda una imagen de las interacciones proteína-ADN que ocurren dentro del núcleo de las células o tejidos vivos. La naturaleza in vivo de este método contrasta con otros enfoques empleados tradicionalmente para responder a las mismas preguntas.
El principio que sustenta este ensayo es que las proteínas de unión al ADN (incluidos los factores de transcripción y las histonas ) en las células vivas pueden entrecruzarse con el ADN al que se unen. Mediante el uso de un anticuerpo que es específico para una supuesta proteína de unión al ADN, se puede inmunoprecipitar el complejo proteína-ADN de los lisados celulares. El entrecruzamiento a menudo se logra aplicando formaldehído a las células (o tejido), aunque a veces es ventajoso usar un entrecruzante más definido y consistente como dimetil 3,3'-ditiobispropionimidato-2 HCl (DTBP). [1] Después de la reticulación, las células se lisany el ADN se rompe en pedazos de 0,2 a 1,0 kb de longitud mediante sonicación . En este punto se realiza la inmunoprecipitación que da como resultado la purificación de los complejos proteína-ADN. Los complejos de proteína-ADN purificados luego se calientan para revertir el entrecruzamiento de formaldehído de los complejos de proteína y ADN, lo que permite que el ADN se separe de las proteínas. La identidad y la cantidad de los fragmentos de ADN aislados pueden determinarse luego mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La limitación de realizar la PCR en los fragmentos aislados es que uno debe tener una idea de qué región genómica se dirige para generar los cebadores de PCR correctos. A veces, esta limitación se elude simplemente clonando el ADN genómico aislado en un vector plasmídico.y luego usando cebadores que son específicos para la región de clonación de ese vector. Alternativamente, cuando se quiere encontrar dónde se une la proteína en una escala de todo el genoma, se utiliza la secuenciación de ChIP y ha surgido recientemente como una tecnología estándar que puede localizar sitios de unión de proteínas de una manera rentable y de alto rendimiento, lo que permite también para la caracterización del cistrome . Anteriormente, también se usaba microarray de ADN ( ChIP-on-chip o ChIP-chip ).
