La electroforesis en gel de campo pulsado es una técnica utilizada para la separación de grandes moléculas de ADN aplicando a una matriz de gel un campo eléctrico que cambia periódicamente de dirección. [1] [2]
Antecedentes históricos
Las técnicas estándar de electroforesis en gel para la separación de moléculas de ADN proporcionaron enormes ventajas para la investigación en biología molecular. Sin embargo, no pudo separar moléculas muy grandes de ADN de manera efectiva. Las moléculas de ADN de más de 15-20 kb que migran a través de un gel se moverán esencialmente juntas de una manera independiente del tamaño. En la Universidad de Columbia en 1984, David C. Schwartz y Charles Cantor desarrollaron una variación del protocolo estándar al introducir un gradiente de voltaje alterno para mejorar la resolución de moléculas más grandes. [3] Esta técnica se conoció como electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). El desarrollo de PFGE amplió el rango de resolución de los fragmentos de ADN hasta en dos órdenes de magnitud.
Procedimiento
El procedimiento para esta técnica es relativamente similar a realizar una electroforesis en gel estándar, excepto que en lugar de hacer funcionar constantemente el voltaje en una dirección, el voltaje cambia periódicamente entre tres direcciones; uno que atraviesa el eje central del gel y dos que corren en un ángulo de 60 grados a cada lado. Los tiempos de pulso son iguales para cada dirección, lo que resulta en una migración neta hacia adelante del ADN. Para moléculas extremadamente grandes (hasta alrededor de 2 Mb), se pueden usar rampas de intervalo de conmutación que aumentan el tiempo del pulso para cada dirección en el transcurso de varias horas; tome, por ejemplo, aumentar el pulso linealmente de 10 segundos a 0 horas a 60 segundos a las 18 horas.
Este procedimiento lleva más tiempo que la electroforesis en gel normal debido al tamaño de los fragmentos que se resuelven y al hecho de que el ADN no se mueve en línea recta a través del gel.
Teoría
Si bien, en general, los fragmentos pequeños pueden encontrar su camino a través de la matriz de gel más fácilmente que los fragmentos de ADN grandes, existe un umbral de longitud por encima de 30-50 kb donde todos los fragmentos grandes se ejecutarán a la misma velocidad y aparecerán en un gel como un solo gran difuso. banda.
Sin embargo, con el cambio periódico de la dirección del campo, las distintas longitudes de ADN reaccionan al cambio a diferentes velocidades. Es decir, las piezas más grandes de ADN tardarán más en realinear su carga cuando se cambie la dirección del campo, mientras que las piezas más pequeñas serán más rápidas. Con el transcurso del tiempo, con el cambio constante de direcciones, cada banda comenzará a separarse cada vez más incluso en longitudes muy grandes. Por tanto, es posible la separación de piezas de ADN muy grandes utilizando PFGE.
Aplicaciones
El PFGE se puede utilizar para la determinación del genotipo o la toma de huellas genéticas . Comúnmente se ha considerado un estándar de oro en estudios epidemiológicos de organismos patógenos durante varias décadas. Por ejemplo, la subtipificación de aislamientos bacterianos con este método ha facilitado la discriminación entre cepas de Listeria monocytogenes y, por lo tanto, la vinculación de aislamientos ambientales o alimentarios con infecciones clínicas. Ahora está en proceso de ser reemplazado por métodos de secuenciación de próxima generación. [4]
Ver también
Referencias
- ^ Kaufmann, Mary Elizabeth (1998). "Electroforesis en gel de campo pulsado". Bacteriología molecular . Métodos en Medicina Molecular. 15 . págs. 33–50. doi : 10.1385 / 0-89603-498-4: 33 . ISBN 0-89603-498-4. PMID 21390741 .
- ^ Herschleb, Jill; Ananiev, Gene; Schwartz, David C (marzo de 2007). "Electroforesis en gel de campo pulsado". Protocolos de la naturaleza . 2 (3): 677–684. doi : 10.1038 / nprot.2007.94 . PMID 17406630 . S2CID 13265518 .
- ^ Schwartz DC, Cantor CR (mayo de 1984). "Separación de ADN del tamaño de cromosomas de levadura por electroforesis en gel de gradiente de campo pulsado" . Celular . 37 (1): 67–75. doi : 10.1016 / 0092-8674 (84) 90301-5 . PMID 6373014 .
- ^ Ribot, Efraín M .; Freeman, Molly; Hise, Kelley B .; Gerner-Smidt, Peter (julio de 2019). "PulseNet: entrando en la era de la secuenciación de próxima generación" . Patógenos y enfermedades transmitidos por los alimentos . 16 (7): 451–456. doi : 10.1089 / fpd.2019.2634 . PMC 6653803 . PMID 31241352 .
enlaces externos
- Método de campo de pulso
- Matemáticas aplicadas BioNumerics Tipeo PFGE