La amplificación rápida de extremos de ADNc ( RACE ) es una técnica utilizada en biología molecular para obtener la secuencia completa de un transcrito de ARN que se encuentra dentro de una célula. RACE da como resultado la producción de una copia de ADNc de la secuencia de ARN de interés, producida a través de la transcripción inversa , seguida de la amplificación por PCR de las copias de ADNc (ver RT-PCR). Las copias de cDNA amplificadas luego se secuencian y, si son lo suficientemente largas, deberían mapearse en una región genómica única. RACE es seguido comúnmente por la clonación antes de la secuenciación de lo que originalmente eran moléculas de ARN individuales. Una alternativa de mayor rendimiento que es útil para la identificación de nuevas estructuras de transcripción es secuenciar los productos RACE mediante tecnologías de secuenciación de próxima generación.
RACE puede proporcionar la secuencia de una transcripción de ARN desde una pequeña secuencia conocida dentro de la transcripción hasta el extremo 5' (5' RACE-PCR) o el extremo 3' (3' RACE-PCR) del ARN. Esta técnica a veces se denomina PCR unilateral o PCR anclada .
El primer paso en RACE es utilizar la transcripción inversa para producir una copia de ADNc de una región de la transcripción de ARN. En este proceso, una parte final desconocida de una transcripción se copia utilizando una secuencia conocida del centro de la transcripción. La región copiada está delimitada por la secuencia conocida, ya sea en el extremo 5' o en el 3'.
Los protocolos para las CARRERAS de 5' o 3' difieren ligeramente. 5' RACE-PCR comienza usando ARNm como molde para una primera ronda de reacción de síntesis de ADNc (o transcripción inversa ) usando un cebador de oligonucleótido antisentido (inverso) que reconoce una secuencia conocida en el medio del gen de interés; el cebador se denomina cebador específico de gen (GSP). El cebador se une al ARNm y la enzima transcriptasa inversa agrega pares de bases al extremo 3' del cebador para generar un producto de ADNc monocatenario específico; este es el complemento inverso del ARNm. Luego de la síntesis de ADNc, la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) se usa para agregar una cadena de células idénticas. nucleótidos , conocida como cola homopolimérica, al extremo 3' del ADNc. (Existen otras formas de agregar la secuencia 3'-terminal para la primera hebra de la síntesis de ADNc de novo que son mucho más eficientes que la cola homopolimérica, pero el sentido del método sigue siendo el mismo). A continuación, se lleva a cabo la PCR , que utiliza un segundo cebador específico de gen antisentido (GSP2) que se une a la secuencia conocida, y un cebador universal (UP) con sentido (directo) que se une a la cola homopolimérica añadida a los extremos 3' del ADNc para amplificar un producto de ADNc del extremo 5'.
3' RACE-PCR utiliza la cola poliA natural que existe en el extremo 3' de todos los ARNm eucarióticos para el cebado durante la transcripción inversa, por lo que este método no requiere la adición de nucleótidos por TdT. Los ADNc se generan utilizando un cebador adaptador Oligo-dT (un cebador con una secuencia corta de nucleótidos de desoxitimina) que complementa el tramo poliA y añade una secuencia adaptadora especial al extremo 5' de cada ADNc. Luego se usa la PCR para amplificar el cDNA 3' de una región conocida usando un GSP sentido y un cebador antisentido complementario a la secuencia adaptadora.
Las moléculas de ADNc generadas por RACE se pueden secuenciar utilizando tecnologías de secuenciación de alto rendimiento (también denominadas RACE-seq). La caracterización de secuenciación de alto rendimiento de fragmentos RACE es muy eficiente en el tiempo, más sensible, menos costosa y técnicamente factible en comparación con la caracterización tradicional de fragmentos RACE con clonación molecular seguida de secuenciación Sanger de unos pocos clones.