Movimiento de partículas atadas

El movimiento de partículas atadas ( TPM ) es un método biofísico que se utiliza para estudiar varios polímeros como el ADN y su interacción con otras entidades como las proteínas .

TPM : la perla se difunde en la solución, pero debido al anclaje, solo puede moverse en un volumen restringido.

El método permite a los observadores medir varias propiedades físicas de las sustancias, así como medir las propiedades de las interacciones bioquímicas con otras sustancias como proteínas y enzimas. TPM es un método de experimento de una sola molécula .

Historia

El TPM fue introducido por primera vez por Schafer, Gelles, Sheetz y Landick en 1991. ^[1] En su investigación, unieron ARN polimerasa a la superficie y perlas de oro se unieron a un extremo de las moléculas de ADN. Al principio, la ARN polimerasa "captura" el ADN cerca de la cuenta de oro. Durante la transcripción , el ADN se "desliza" sobre la ARN polimerasa, por lo que la distancia entre la ARN polimerasa y la cuenta de oro (la longitud de la correa) aumenta. Usando un microscopio óptico, se detectó el área en la que se mueve la perla. La tasa de transcripción se extrajo de los datos.
Desde entonces, se han realizado muchos experimentos de TPM y el método se mejoró de muchas maneras, como tipos de perlas, técnicas de bioquímica, análisis de datos de imágenes (cámaras más rápidas, diferentes métodos de microscopía, etc.) y combinación con otras técnicas de molécula única ( p. ej. pinzas ópticas o magnéticas).

Principio del método

Un extremo de un polímero está unido a una pequeña cuenta (decenas a cientos de nanómetros), mientras que el otro extremo está unido a una superficie. Tanto el polímero como la perla permanecen en un ambiente acuoso, por lo que la perla se mueve con un movimiento browniano . Debido a la atadura, el movimiento está restringido. Usando un microscopio óptico y una cámara CCD , se puede rastrear la posición de la cuenta en una serie de tiempo. Aunque la cuenta suele ser más pequeña que el límite de difracción , por lo que la imagen es un punto que es más grande que la propia cuenta ( función de dispersión de puntos ), el centro del punto representa la proyección en el plano XY del extremo del polímero ( final vector de extremo a extremo ). El análisis de la distribución de la posición de las perlas puede darnos mucha información sobre el polímero.

Simulación TPM . La simulación realizada por MATLAB , utilizando el modelo de polímeros de cadena libremente articulada . Los puntos verdes representan la proyección del vector de extremo a extremo del polímero en el plano XY.

Número de excursión

Para que el movimiento sea dominado por polímeros, y no dominado por perlas, uno debe notar que el número de excursión, N _R , ^[2] será menor que 1:

{\ Displaystyle N_ {R} \ equiv {\ frac {r} {\ sqrt {L \ cdot {l_ {p} / 3}}}} <1}

dónde ${\ Displaystyle r}$ es el radio de la cuenta, ${\ Displaystyle L}$ es la longitud del contorno del polímero y ${\ Displaystyle l_ {p}}$ es la longitud de persistencia (50 nm en condiciones fisiológicas) del polímero. (Es posible trabajar también cuando ${\ Displaystyle N_ {R}> 1}$ , pero debe tratarse con cuidado).

Tipos de cuentas

Las perlas metálicas (generalmente doradas) dispersan la luz con alta intensidad, por lo que se pueden usar perlas muy pequeñas (~ 40 nm de diámetro) y aún así tener una buena imagen. Por otro lado, las perlas metálicas no son la herramienta adecuada para los experimentos con pinzas ópticas .

Las perlas de poliestireno dispersan la luz más débil que las metálicas (para obtener la misma intensidad que la perla de oro de 40 nm, ¡la perla de poliestireno debe ser de ~ 125 nm! ^[3] ), pero tiene la ventaja de que se puede combinar con pinzas ópticas. experimentos.

La principal ventaja de las fluoroesferas es que la longitud de onda de excitación y la longitud de onda de emisión no son la misma, por lo que se puede usar un filtro dicroico para dar una señal más limpia. La desventaja de las fluoroesferas es el fotoblanqueo .

Todos los tipos y diámetros de perlas (con el marcador bioquímico, consulte la sección de ensamblaje de la correa) son fabricados por empresas comerciales y se pueden comprar fácilmente.

Conjunto de chip y correa

Ensamblaje de chips

Un chip puede estar hecho de dos cubreobjetos. Uno de ellos debe perforarse para hacer dos orificios, lo que permite inyectar los reactivos en la celda de flujo. Los portaobjetos deben limpiarse para eliminar la suciedad. Un sonicador de baño es una buena herramienta para eso, 15 minutos en isopropanol deberían ser suficientes. A continuación, se debe crear un canal. Una forma de hacerlo es cortar parafilm en el centro, dejando un marco de parafilm que se usaría como espaciador entre las diapositivas. Los portaobjetos deben ensamblarse uno sobre otro con el parafilm cortado entre ellos. El último paso es calentar el chip para que el parafilm se derrita y pegue los portaobjetos.

Ensamblaje de amarre

Primero, el chip debe pasivarse para que el polímero no se pegue al vidrio, hay muchos reactivos de bloqueo disponibles (BSA, alfa-caseína, etc.) y uno debe encontrar lo que funciona mejor para la situación específica. A continuación, la superficie debe estar recubierta con un anticuerpo u otra molécula reactiva (como anti- digoxigenina ) que se unirá a un antígeno ( digoxigenina ) en un extremo del polímero. Después de una incubación de aproximadamente 45 minutos, el exceso de anticuerpo debe eliminarse mediante lavado. Después de lavar el exceso de anticuerpo, el polímero debe inyectarse en el chip e incubarse durante aproximadamente el mismo tiempo. El polímero se había modificado antes en los extremos. Un extremo tiene una cola de biotina y el otro tiene una cola de digoxigenina. Después de la incubación, el polímero no unido debe eliminarse por lavado de la celda. Entonces, anti- biotina perlas recubiertas se deben inyectar a la celda de flujo y se incuba durante aproximadamente 30-45 minutos. El exceso de perlas debe lavarse.

Análisis de los datos

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Reproducir medios

Video tomado del experimento TPM, usando microscopio de campo oscuro. Las cuentas enmarcadas en verde son cuentas atadas y las enmarcadas en rojo son cuentas inmovilizadas.

Seguimiento

Como se mencionó anteriormente, la imagen no muestra la cuenta en sí, sino un lugar más grande de acuerdo con su PSF ( función de dispersión de puntos ). Además, el tamaño de píxel de la cámara puede reducir la resolución de la medida. Para extraer la posición exacta de la cuenta (que corresponde al vector de extremo a extremo), el centro del punto debe encontrarse lo más preciso posible. Se puede hacer con buena resolución utilizando dos técnicas diferentes, ambas basadas en las características del punto. La intensidad de la luz en el plano focal se distribuye como un disco aireado y tiene simetría circular.

Una función gaussiana bidimensional es una buena aproximación para un disco aireado . Al ajustar esta función al lugar, se pueden encontrar los parámetros ${\ Displaystyle x_ {0}}$ y ${\ Displaystyle y_ {0}}$ que son las coordenadas del centro del punto y del vector de extremo a extremo.

La segunda técnica consiste en encontrar el centro de intensidad, ^[4] utilizando la definición de centro de masa :

{\ Displaystyle {\ vec {R}} _ {cm} = {\ frac {1} {I_ {tot}}} \ cdot \ sum _ {k = 1} ^ {N} I_ {k} \ cdot {\ vec {r}} _ {k}}

dónde ${\ Displaystyle {\ vec {R}} _ {cm}}$ es la coordenada del centro de masa, ${\ Displaystyle \ textstyle I_ {tot}}$ es la intensidad total de la mancha, y ${\ Displaystyle \ textstyle I_ {k}}$ y ${\ Displaystyle \ textstyle {\ vec {r}} _ {k}}$ son la intensidad y la coordenada del k -ésimo píxel. Debido a la simetría circular, la coordenada del centro de intensidad es la coordenada del centro de la cuenta.
Ambas técnicas nos dan la coordenada del vector de extremo a extremo en una resolución mejor que el tamaño de píxel.

Deriva de TPM: arriba: el gráfico verde son los datos del experimento de TPM, la curva negra es el suavizado de los datos (la deriva). bottom: resta de la deriva de los datos.

Corrección de deriva

Por lo general, todo el sistema se desvía durante la medición. Existen varios métodos para corregir la deriva, generalmente estos se pueden dividir en 3 grupos:

La frecuencia de movimiento browniano es mucho mayor que la frecuencia de deriva, por lo que se puede utilizar un filtro de paso alto para eliminar la deriva. Se puede lograr un efecto similar suavizando los datos y restando el suavizado de los datos (ver figura).

Si se muestran pocas cuentas en el cuadro, debido a que cada cuenta se mueve al azar, promediar la posición de ellas para cada cuadro debería darnos la deriva (se debe restar de los datos para tener datos limpios).

Si se muestra un talón inmovilizado en el cuadro, podemos tomar su posición como referencia y corregir los datos por la posición del talón inmovilizado. (Otra ventaja de mirar una cuenta inmovilizada es el hecho de que el movimiento de la misma puede indicarnos la precisión de la medida).
Por supuesto, se puede usar más de un método.

Caracterización de polímeros

Es común ajustar las estadísticas de recorrido aleatorio al vector de extremo a extremo del polímero. ^[5] Para unidimensional obtendremos la distribución Normal y para bidimensionales la distribución de Rayleigh :

{\ Displaystyle P_ {1D} (x) dx = {\ sqrt {\ frac {3} {4 {\ pi} Ll_ {p}}}} \ exp {\ left (- {\ frac {3x ^ {2} } {4Ll_ {p}}} \ derecha)} dx \, \, \,; \, \, \, \, \, \, P_ {2D} (R) dR = 2 {\ pi} R {\ frac {3} {4 {\ pi} Ll_ {p}}} \ exp {\ left (- {\ frac {3R ^ {2}} {4Ll_ {p}}} \ right)} dR}

dónde ${\ Displaystyle L}$ es la longitud del contorno y ${\ Displaystyle l_ {p}}$ es la duración de la persistencia.
Después de recopilar los datos de las series de tiempo, se debe ajustar el histograma de los datos a la función de distribución (unidimensional o bidimensional). Si se conoce la longitud del contorno del polímero, el único parámetro de ajuste es la longitud de persistencia.

Constante de resorte

Debido a la fuerza entrópica , el polímero actúa como un resorte de Hookian. Según la distribución de Boltzmann , la distribución es proporcional al exponente de la relación entre la energía elástica y la energía térmica :

{\ Displaystyle P (x) \ propto \ exp {\ left (- {\ frac {{\ frac {1} {2}} kx ^ {2}} {K_ {B} T}} \ right)}}

dónde ${\ Displaystyle k}$ es la constante del resorte , ${\ Displaystyle K_ {B}}$ es la constante de Boltzmann y ${\ Displaystyle T}$ es la temperatura. Tomando el logaritmo de la distribución ${\ Displaystyle P (x)}$ y ajustándolo a una forma de parábola , se puede obtener la constante elástica del polímero: ^[6]

{\ Displaystyle \ Displaystyle k = 2 {\ alpha} K_ {B} T}

dónde ${\ Displaystyle \ alpha}$ es el coeficiente de ${\ Displaystyle x ^ {2}}$ del ajuste de la parábola.

Ventaja y desventaja

Las ventajas incluyen una configuración simple, costo, el hecho de que las observaciones se realizan en el entorno natural del polímero (no se utilizan fuerzas externas), es adecuado para varios métodos de microscopía (por ejemplo , TIRFM , campo oscuro , microscopía de contraste de interferencia diferencial , etc.), se puede combinar y manipular utilizando otros métodos, y hay una gran variedad de aplicaciones. ^{[ cita requerida ]} Las desventajas incluyen baja resolución espacial (~ 30 nm) y que se ajusta solo a experimentos in vitro . ^{[ cita requerida ]}

Ver también

Seguimiento de una sola partícula
Experimento de una sola molécula

Referencias

^ Schafer, DA, et al., Transcripción por moléculas individuales de ARN polimerasa observadas por microscopía óptica. Nature, 1991. 352 : pág. 444-448.
^ Segall, DE; et al. (2006). "Efectos de exclusión de volumen en experimentos de partículas atadas: el tamaño de las perlas importa" . Cartas de revisión física . 96 (8): 088306. arXiv : q-bio / 0508028 . Código bibliográfico : 2006PhRvL..96h8306S . doi : 10.1103 / PhysRevLett.96.088306 . PMC 3261840 . PMID 16606235 .
^ Paul R. Selvin, Taekjip Ha, Técnicas de molécula única (Capítulo 19) , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2008
^ Blumberg, S., et al., Caracterización tridimensional de microesferas atadas por microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Biophysical Journal, 2005. 89 : p. 1272-1281. ^{[ enlace muerto ]}
^ Rubinstein, M. y Colby, RH, Física de polímeros (capítulo 2.5 - Distribución de vector de extremo a extremo) , OXFORD University Press (2003).
^ Dietrich, HRC, et al., Un nuevo método óptico para caracterizar interacciones de una sola molécula basado en microscopía de campo oscuro. Actas del SPIE, 2007. doi : 10.1117 / 12.699040

[1] Schafer, DA, et al., Transcripción por moléculas individuales de ARN polimerasa observadas por microscopía óptica. Nature, 1991. 352 : pág. 444-448.

[2] Segall, DE; et al. (2006). "Efectos de exclusión de volumen en experimentos de partículas atadas: el tamaño de las perlas importa" . Cartas de revisión física . 96 (8): 088306. arXiv : q-bio / 0508028 . Código bibliográfico : 2006PhRvL..96h8306S . doi : 10.1103 / PhysRevLett.96.088306 . PMC 3261840 . PMID 16606235 .

[3] Paul R. Selvin, Taekjip Ha, Técnicas de molécula única (Capítulo 19) , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2008

[4] Blumberg, S., et al., Caracterización tridimensional de microesferas atadas por microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Biophysical Journal, 2005. 89 : p. 1272-1281. ^{[ enlace muerto ]}

[5] Rubinstein, M. y Colby, RH, Física de polímeros (capítulo 2.5 - Distribución de vector de extremo a extremo) , OXFORD University Press (2003).

[6] Dietrich, HRC, et al., Un nuevo método óptico para caracterizar interacciones de una sola molécula basado en microscopía de campo oscuro. Actas del SPIE, 2007. doi : 10.1117 / 12.699040

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