La modulación genética terapéutica se refiere a la práctica de alterar la expresión de un gen en una de varias etapas, con el fin de aliviar alguna forma de dolencia. Se diferencia de la terapia génica en que la modulación genética busca alterar la expresión de un gen endógeno (quizás mediante la introducción de un gen que codifica una proteína moduladora novedosa) mientras que la terapia génica se refiere a la introducción de un gen cuyo producto ayuda directamente al receptor.
La modulación de la expresión génica puede estar mediada al nivel de la transcripción por agentes de unión al ADN (que pueden ser factores de transcripción artificiales ), moléculas pequeñas u oligonucleótidos sintéticos . También puede estar mediada postranscripcionalmente a través de la interferencia de ARN .
Modulación genética transcripcional
Un enfoque de la modulación terapéutica utiliza agentes que modulan la transcripción endógena dirigiéndose específicamente a esos genes a nivel de ADNg . La ventaja de este enfoque sobre la modulación a nivel de ARNm o proteína es que cada célula contiene solo una copia de ADNg. Por tanto, el número de copias objetivo es significativamente menor, lo que permite que los fármacos se administren teóricamente a dosis mucho más bajas.
Este enfoque también ofrece varias ventajas sobre la terapia génica tradicional . Dirigirse directamente a la transcripción endógena debería producir la expresión relativa correcta de las variantes de corte y empalme . En contraste, la terapia génica tradicional típicamente introduce un gen que puede expresar solo una transcripción, en lugar de un conjunto de variantes de transcripción empalmadas expresadas estequiométricamente. Además, los genes introducidos por virus pueden dirigirse al silenciamiento de genes mediante metilación, lo que puede contrarrestar el efecto de la terapia génica tradicional. [1] No se prevé que esto sea un problema para la modulación transcripcional, ya que actúa sobre el ADN endógeno.
Hay tres categorías principales de agentes que actúan como moduladores de genes transcripcionales: oligonucleótidos formadores de triplex (TFO), poliamidas sintéticas (SPA) y proteínas de unión al ADN . [2]
Oligonucleótidos formadores de triplex
Qué son
Los oligonucleótidos formadores de tríplex (TFO) son un método potencial para lograr la modulación genética terapéutica. Los TFO tienen aproximadamente 10-40 pares de bases de largo y pueden unirse en el surco principal del ADN dúplex, lo que crea una tercera hebra o una triple hélice. [2] [3] La unión ocurre en las regiones de polipurina o polipirimidina a través de enlaces de hidrógeno de Hoogsteen a las bases de purina (A / G) en el ADN bicatenario que ya está en forma de hélice Watson-Crick . [4]
Cómo trabajan ellos
Los TFO pueden ser moléculas de polipurina o polipirimidina y unirse a una de las dos hebras en la doble hélice en orientación paralela o antiparalela para apuntar a las regiones de polipurina o polipirimidina. Dado que los códigos de reconocimiento de ADN son diferentes para el modo paralelo y antiparalelo de la unión de TFO, los TFO compuestos de pirimidinas (C / T) se unen a la hebra rica en purina de la doble hélice diana a través de enlaces de hidrógeno de Hoogsteen de forma paralela . [3] Los TFO compuestos de purinas (A / G), o purina y pirimidina mezcladas, se unen a la misma hebra rica en purinas mediante enlaces de Hoogsteen inversos de forma antiparalela. Los TFO pueden reconocer hebras diana ricas en purina para ADN dúplex. [2]
Complicaciones y limitaciones
Para que los motivos de TFO se unan de manera paralela y creen enlaces de hidrógeno , el átomo de nitrógeno en la posición 3 del residuo de citosina debe protonarse , pero a niveles de pH fisiológico no es así, lo que podría evitar la unión en paralelo. [2]
Otra limitación es que los TFO sólo pueden unirse a cadenas diana ricas en purina y esto limitaría la elección de sitios diana de genes endógenos a tramos de polipurina-polipirimidina en ADN dúplex. Si se generara un método que también permitiera que los TFO se unieran a las bases de pirimidina, esto permitiría que los TFO se dirigieran a cualquier parte del genoma . Además, el genoma humano es rico en secuencias de polipurina y polipirimidina que podrían afectar la especificidad de TFO para unirse a una región de ADN diana. Un enfoque para superar esta limitación es desarrollar TFO con nucleótidos modificados que actúan como ácidos nucleicos bloqueados para aumentar la afinidad del TFO por secuencias diana específicas. [5]
Otras limitaciones incluyen preocupaciones con respecto a la afinidad y especificidad de unión , la estabilidad in vivo y la captación en las células. Los investigadores están intentando superar estas limitaciones mejorando las características del TFO mediante modificaciones químicas , como la modificación de la columna vertebral del TFO para reducir las repulsiones electrostáticas entre el TFO y el dúplex del ADN. También debido a su alto peso molecular, la captación en las células es limitada y algunas estrategias para superar esto incluyen agentes de condensación de ADN , acoplamiento del TFO a residuos hidrófobos como el colesterol o agentes de permeabilización celular. [2]
Qué pueden hacer
Los científicos todavía están perfeccionando la tecnología para convertir los TFO en un producto terapéutico y gran parte de esto gira en torno a sus posibles aplicaciones en la terapia antigénica. En particular, se han utilizado como inductores de mutaciones específicas de sitio , reactivos que escinden selectiva y específicamente el ADN diana y como moduladores de la expresión génica . [6] Uno de estos métodos de modificación de la secuencia de genes es a través del ADN dirigido con TFO para activar un gen diana . Si una secuencia diana se encuentra entre dos copias inactivas de un gen, los ligandos de ADN, como los TFO, pueden unirse al sitio diana y se reconocerían como lesiones de ADN. Para reparar estas lesiones, los complejos de reparación del ADN se ensamblan en la secuencia objetivo y se repara el ADN. El daño del sustrato de recombinación intramolecular se puede reparar y detectar si la resección va lo suficientemente lejos como para producir extremos compatibles en ambos lados del sitio de escisión y luego se ligan los salientes 3 ', lo que lleva a la formación de una única copia activa del gen y la pérdida. de todas las secuencias entre las dos copias del gen. [4]
En los sistemas modelo, los TFO pueden inhibir la expresión génica a nivel del ADN, así como inducir mutagénesis dirigida en el modelo. [6] La inhibición inducida por TFO de la elongación de la transcripción en dianas endógenas se ha probado con éxito en cultivos celulares. [7] Sin embargo, a pesar del gran éxito in vitro , ha habido logros limitados en aplicaciones celulares debido potencialmente a la accesibilidad del objetivo.
Los TFO tienen el potencial de silenciar el gen silenciado dirigiéndose al inicio o elongación de la transcripción, deteniéndose en los sitios de unión del triplete o introduciendo cambios permanentes en una secuencia diana mediante la estimulación de las vías de reparación inherentes de una célula. Estas aplicaciones pueden ser relevantes en la creación de terapias contra el cáncer que inhiben la expresión génica a nivel del ADN. Dado que la expresión génica aberrante es un sello distintivo del cáncer, la modulación de los niveles de expresión de estos genes endógenos podría actuar potencialmente como una terapia para múltiples tipos de cáncer .
Poliamidas sintéticas
Las poliamidas sintéticas son un conjunto de pequeñas moléculas que forman enlaces de hidrógeno específicos con el surco menor del ADN. Pueden ejercer un efecto directamente, uniendo una región reguladora o una región transcrita de un gen para modificar la transcripción, o indirectamente, mediante una conjugación diseñada con otro agente que produce alteraciones alrededor del sitio diana del ADN.
Estructura
Las bases específicas en el surco menor del ADN pueden reconocerse y unirse mediante pequeñas poliamidas sintéticas (SPA). Los SPA que se unen al ADN se han diseñado para contener tres componentes de aminoácidos de poliamida: hidroxipirrol (Hp), imidazol (Im) y pirrol (Py). [10] Las cadenas de estos aminoácidos se enrollan sobre sí mismas en una estructura de horquilla. Los aminoácidos a cada lado de la horquilla forman un par que puede reconocer específicamente ambos lados de un par de bases Watson-Crick . Esto ocurre a través de enlaces de hidrógeno dentro del surco menor del ADN. Los pares de amidas Py / Im, Py / Hp, Hp / Py e Im / Py reconocen los pares de bases de Watson-Crick CG, AT, TA y GC, respectivamente (Tabla 1). Consulte la figura para ver una representación gráfica del reconocimiento de 5'-GTAC-3 'por parte de un SPA. Los SPA tienen baja toxicidad, pero aún no se han utilizado en la modulación de genes humanos.
Par de amida | Par de nucleótidos |
---|---|
Py / Im | CG |
Py / Hp | A |
Hp / Py | ejército de reserva |
Im / Py | GC |
Limitaciones y soluciones
El principal inconveniente estructural de las SPA no modificadas como moduladores de genes es que su secuencia de reconocimiento no puede extenderse más allá de 5 emparejamientos de bases Watson-Crick. La curvatura natural del surco menor del ADN es un giro demasiado estrecho para que coincida la estructura de la horquilla. Hay varios grupos con soluciones alternativas propuestas para este problema. [8] [11] [12] [13] [14] Se pueden hacer SPA para seguir mejor la curvatura del surco menor insertando beta-alanina que relaja la estructura. [10] Otro enfoque para extender la longitud del reconocimiento es usar varias horquillas cortas sucesivamente. [15] [16] Este enfoque ha aumentado la longitud de reconocimiento hasta once pares de bases Watson-Crick.
Modulación directa
Los SPA pueden inhibir la transcripción mediante la unión dentro de una región transcrita de un gen diana. Esta inhibición se produce mediante el bloqueo del alargamiento por una ARN polimerasa.
Los SPA también pueden modular la transcripción dirigiéndose a un sitio de unión del regulador de la transcripción. Si el regulador es un activador de la transcripción, esto disminuirá los niveles de transcripción. Como ejemplo, se ha demostrado que la focalización de SPA en el sitio de unión para el factor de transcripción activador TFIIIA inhibe la transcripción del ARN 5S aguas abajo. [17] Por el contrario, si el regulador es un represor, esto aumentará los niveles de transcripción. Como ejemplo, el SPA dirigido al factor anfitrión LSF, que reprime la expresión del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) tipo 1 de repetición terminal larga (LTR), bloquea la unión de LSF y, en consecuencia, des-reprime la expresión de LTR [18] .
Modulación conjugada
No se ha demostrado que las SPA modifiquen directamente el ADN o tengan una actividad distinta al bloqueo directo de otros factores o procesos. Sin embargo, los agentes modificadores pueden unirse a los extremos de la estructura de la horquilla. La unión específica del SPA al ADN permite el direccionamiento específico del sitio del agente modificador conjugado.
Los SPA se han emparejado con los restos de alquilación de ADN ciclopropilpirroloindol [19] y clorambucilo [20] que fueron capaces de dañar y reticular el ADN de SV40. Este efecto inhibió el ciclo y el crecimiento celular. El clorambucil, un agente quimioterapéutico, fue más eficaz cuando se conjugó con un SPA que sin él.
En 2012, los SPA se conjugaron con SAHA, un potente inhibidor de histona desacetilasa (HDAC). [21] Los SPA con SAHA conjugado se dirigieron a Oct-3/4 y Nanog, lo que indujo una remodelación epigenética y, en consecuencia, aumentó la expresión de múltiples genes relacionados con la pluripotencia en fibroblastos embrionarios de ratón.
Proteínas de dedos de zinc de diseño
Que son / estructura
Las proteínas diseñadas con dedos de zinc son proteínas diseñadas que se utilizan para apuntar a áreas específicas del ADN . Estas proteínas aprovechan la capacidad de unión al ADN de los dominios de dedos de zinc naturales para modular áreas específicas del genoma . [22] Tanto en los motivos de dedos de zinc naturales como en los de diseñador, la proteína consta de dos láminas β y una hélice α . Dos residuos de histidina en la hélice α y dos residuos de cisteína en las láminas β están unidos a un átomo de zinc , que sirve para estabilizar el dominio de la proteína como un todo. Esta estabilización beneficia particularmente a la hélice α en su función como dominio de unión y reconocimiento de ADN. El factor de transcripción TFIIIA es un ejemplo de una proteína de origen natural con motivos de dedos de zinc. [23]
Cómo trabajan ellos
Los motivos de dedos de zinc se unen al surco principal del ADN helicoidal, [23] donde la secuencia de residuos de aminoácidos en la hélice α le da al motivo su especificidad de secuencia diana. El dominio se une a una secuencia de ADN de siete nucleótidos (posiciones 1 a 6 en la cadena primaria de ADN, más posiciones 0 y 3 en la cadena complementaria ), asegurando así que el motivo proteico sea altamente selectivo de su objetivo. [22] Al diseñar una proteína de dedo de zinc de diseño, los investigadores pueden utilizar técnicas como la mutagénesis dirigida al sitio seguida de ensayos aleatorizados para determinar la capacidad de unión, [22] [24] o la recombinación in vitro de motivos con especificidad diana conocida para producir una biblioteca de proteínas finales específicas de secuencia. [25]
Efectos e impactos sobre la modulación genética
Las proteínas diseñadas con dedos de zinc pueden modular la expresión del genoma de varias formas. En última instancia, dos factores son los principales responsables del resultado final de la expresión: si la secuencia diana es una región reguladora o una región codificante de ADN, y si y qué tipos de dominios efectores están unidos al dominio de dedos de zinc. Si la secuencia diana para una proteína de diseño diseñada es un dominio regulador, por ejemplo, un promotor o un represor de la replicación , el sitio de unión para los factores de transcripción que ocurren naturalmente se oscurecerá, lo que conducirá a una disminución o aumento correspondiente, respectivamente, en la transcripción de el gen asociado . [26] De manera similar, si la secuencia objetivo es un exón , el dedo de zinc del diseñador ocultará la secuencia de los complejos de transcripción de la ARN polimerasa , lo que dará como resultado un producto génico truncado o no funcional. [22]
Los dominios efectores unidos al dedo de zinc también pueden tener efectos comparables. Es la función de estos dominios efectores la que posiblemente sea la más importante con respecto al uso de proteínas diseñadas con dedos de zinc para la modulación genética terapéutica. Si un dominio de metilasa se une a la proteína de dedo de zinc de diseño, cuando la proteína de dedo de zinc se une a la secuencia de ADN diana , se producirá posteriormente un aumento en el estado de metilación del ADN en esa región. Se reducirán las tasas de transcripción de genes así afectados. [27] Muchos de los dominios efectores funcionan para modular el ADN directamente, por ejemplo, mediante metilación, escisión, [28] o recombinación de la secuencia de ADN diana [29] , o modulando su velocidad de transcripción, por ejemplo, inhibiendo la transcripción a través de dominios represores que bloquean la maquinaria transcripcional, [30] promoviendo la transcripción con dominios de activación que reclutan maquinaria transcripcional al sitio, [31] o histonas u otros dominios de modificación epigenética que afectan el estado de la cromatina y la capacidad de la maquinaria transcripcional para acceder a los genes afectados. [32] La modificación epigenética es un tema importante en la determinación de los diferentes niveles de expresión de los genes, como se explica por la idea de que cuán apretada está la cadena de ADN, desde las histonas a nivel local hasta la cromatina a nivel cromosómico , puede influir en la accesibilidad. de secuencias de ADN a la maquinaria de transcripción, lo que influye en la velocidad a la que se puede transcribir. [23] Si, en lugar de impactar directamente en la cadena de ADN, como se describió anteriormente, una proteína de dedo de zinc de diseño afecta el estado de modificación epigenética de una región de ADN diana, la modulación de la expresión génica podría lograrse de manera similar.
En el primer caso para demostrar con éxito el uso de proteínas de dedos de zinc de diseño para modular la expresión génica in vivo , Choo et al [26] diseñaron una proteína que consta de tres dominios de dedos de zinc que se dirigían a una secuencia específica en un oncogén de fusión BCR-ABL . Este oncogén específico está implicado en la leucemia linfoblástica aguda . El oncogén típicamente permite que las células leucémicas proliferen en ausencia de factores de crecimiento específicos, un sello distintivo del cáncer . Al incluir una señal de localización nuclear con la proteína de dedo de zinc de tres dominios para facilitar la unión de la proteína al ADN genómico en el núcleo, Choo et al pudieron demostrar que su proteína diseñada podría bloquear la transcripción del oncogén in vivo. Las células leucémicas se volvieron dependientes de factores de crecimiento regulares, lo que devolvió el ciclo celular al control de la regulación normal . [26]
Modulación genética postranscripcional
El enfoque principal para la modulación génica postranscripcional es a través de la interferencia de ARN (ARNi). El principal problema con el uso de ARNi en la modulación de genes es la administración de fármacos a las células diana. [33] [34] La modulación del gen ARNi se ha aplicado con éxito a ratones para el tratamiento de un modelo de ratón para la enfermedad inflamatoria intestinal. [35] Este tratamiento utilizó nanopartículas estabilizadas dirigidas a la integrina beta-7 basadas en liposomas que atrapaban ARN de interferencia cortos (ARNip). Hay varias otras formas de administración de ARNi, que incluyen: administración polyplex, conjugados ligando-ARNip, administración desnuda, administración de partículas inorgánicas mediante nanopartículas de oro y administración local específica en un sitio. [36]
Significación clínica
Las proteínas diseñadas con dedos de zinc, por otro lado, se han sometido a algunos ensayos en el ámbito clínico . La eficacia y seguridad de EW-A-401, un factor de transcripción de dedos de zinc diseñado, como agente farmacológico para el tratamiento de la claudicación , una enfermedad cardiovascular , se ha investigado en ensayos clínicos. [37] La proteína consiste en un ADN plasmídico diseñado que incita al paciente a producir un factor de transcripción diseñado, cuyo objetivo es el gen del factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A) , que influye positivamente en el desarrollo de los vasos sanguíneos . Aunque aún no ha sido aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA), se han completado dos estudios clínicos de Fase I que identifican esta proteína de dedo de zinc como un agente terapéutico potencial prometedor y seguro para el tratamiento de la enfermedad arterial periférica en humanos. [38]
Ver también
- Factor de transcripción artificial
- Terapia antisentido
- Terapia de genes
- Interferencia de ARN
Referencias
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