La transferencia de energía de fluorescencia resuelta en el tiempo ( TR-FRET ) es la combinación práctica de fluorometría resuelta en el tiempo (TRF) con la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) que ofrece una poderosa herramienta para los investigadores de descubrimiento de fármacos. TR-FRET combina el aspecto de fondo bajo de TRF con el formato de ensayo homogéneo de FRET. El ensayo resultante proporciona un aumento en la flexibilidad, confiabilidad y sensibilidad, además de un mayor rendimiento y menos resultados falsos positivos / falsos negativos. FRET involucra dos fluoróforos , un donante y un aceptor. [1]La excitación del donante por una fuente de energía (por ejemplo, una lámpara de destello o un láser) produce una transferencia de energía al aceptor si los dos están dentro de una determinada proximidad entre sí. El aceptor, a su vez, emite luz en su longitud de onda característica.
El aspecto FRET de la tecnología está impulsado por varios factores, incluido el solapamiento espectral y la proximidad de los fluoróforos involucrados, en donde la transferencia de energía ocurre solo cuando la distancia entre el donante y el aceptor es lo suficientemente pequeña. En la práctica, los sistemas FRET se caracterizan por el radio de Förster (R 0 ): la distancia entre los fluoróforos a la que la eficiencia FRET es del 50%. Para muchas separaciones FRET, R 0 se encuentra entre 20 y 90 Å, dependiendo del aceptor utilizado y las disposiciones espaciales de los fluoróforos dentro del ensayo. [1] Mediante la medición de esta transferencia de energía, se pueden evaluar las interacciones entre biomoléculas acoplando a cada socio con una etiqueta fluorescente y detectando el nivel de transferencia de energía. La emisión del aceptador como una medida de la transferencia de energía se puede detectar sin necesidad de separar los componentes del ensayo unidos de los no unidos (por ejemplo, una etapa de filtración o lavado), lo que reduce el tiempo y el costo del ensayo. [2]
Ventajas
Los ensayos TR-FRET homogéneos de mezcla y lectura ofrecen ventajas sobre otros ensayos de detección biomolecular, como los ensayos de polarización de fluorescencia (FP) o TRF. [3] En los ensayos de FP, la fluorescencia de fondo debida a los compuestos de la biblioteca normalmente se despolariza y la señal de fondo debida a la luz dispersa (por ejemplo, compuestos precipitados) normalmente se polariza. Dependiendo de la configuración del ensayo, cualquiera de los dos casos puede dar lugar a un resultado falso positivo o falso negativo. Sin embargo, debido a que la especie donante utilizada en un ensayo TR-FRET tiene una vida útil fluorescente que es muchos órdenes de magnitud más larga que la fluorescencia de fondo o la luz dispersa, la señal de emisión resultante de la transferencia de energía se puede medir después de que cualquier señal interferente haya decaído por completo. Los ensayos TR-FRET también pueden formatearse para utilizar concentraciones de receptor limitante y trazador en exceso (a diferencia de los ensayos FP), lo que puede proporcionar un mayor ahorro de costes. [4] En el caso de los ensayos de TRF, se requiere un paso de lavado para eliminar los reactivos fluorescentes no unidos antes de medir la señal de actividad del ensayo. Esto aumenta el uso de reactivos, el tiempo para completar el ensayo y limita la capacidad de miniaturizar el sistema (por ejemplo, convertir de una placa de microtitulación de 384 pocillos a una placa de 1536 pocillos ). [5] Los ensayos TR-FRET aprovechan la proximidad requerida de las especies donante y aceptora para la generación de señal.
Además, algunos investigadores prefieren este método, ya que no depende de materiales radiactivos para generar la señal que se va a detectar. Esto evita tanto los peligros del uso de los materiales como el costo y la logística de almacenamiento, uso y eliminación. [6]
Componentes
Aunque TR-FRET se puede lograr con una variedad de combinaciones de fluoróforos, los metales lantánidos son particularmente útiles. Algunas aplicaciones de las ciencias de la vida aprovechan las propiedades de fluorescencia únicas de los complejos de iones lantánidos (quelatos o criptatos de Ln (III)). Estos son muy adecuados para esta aplicación debido a sus grandes cambios de Stokes y vidas de emisión extremadamente largas (de microsegundos a milisegundos) en comparación con los fluoróforos más tradicionales (por ejemplo, fluoresceína, aloficoyanina, ficoeritrina y rodamina). Los fluidos biológicos o suero comúnmente usados en estas aplicaciones de investigación contienen muchos compuestos y proteínas que son naturalmente fluorescentes. Por lo tanto, el uso de la medición de fluorescencia en estado estable convencional presenta serias limitaciones en la sensibilidad del ensayo. Los fluoróforos de larga duración, como los lantánidos, combinados con la detección resuelta en el tiempo (un retraso entre la detección de la excitación y la emisión) minimizan la interferencia de fluorescencia inmediata. Este método (comúnmente conocido como fluorometría resuelta en el tiempo o TRF) involucra dos fluoróforos: un donante y un aceptor. La excitación del fluoróforo donante (en este caso, el complejo de iones lantánidos) por una fuente de energía (por ejemplo, lámpara de destello o láser) produce una transferencia de energía al fluoróforo aceptor si están dentro de una proximidad determinada entre sí (conocido como radio de Förster ). El fluoróforo aceptor a su vez emite luz en su longitud de onda característica. Los dos lantánidos más utilizados en los ensayos de ciencias de la vida se muestran a continuación junto con su colorante aceptor correspondiente, así como sus longitudes de onda de excitación y emisión y el desplazamiento de Stokes resultante (separación de longitudes de onda de excitación y emisión).
Emparejamientos comunes de donante-aceptor de lantánidos
Donante [7] | Excitación⇒ Emisión λ (nm) | Aceptador | Excitación⇒ Emisión λ (nm) | Cambio de Stokes (nm) (excitación del donante ⇒ emisión del aceptor) |
---|---|---|---|---|
Europio 3+ | 340⇒615 | Aloficocianina | 615⇒660 | 320 |
Terbio 3+ | 340⇒545 | Ficoeritrina | 545⇒575 | 235 |
Ejemplo de TR-FRET
Como se indica en la tabla anterior, la transferencia de energía fluorescente desde el europio a la aloficocianina se puede usar de una manera resuelta en el tiempo, particularmente en ensayos de cribado biomolecular. La figura de la derecha muestra la intersección de la emisión del europio con la excitación de la aloficocianina (APC) donde se produce la transferencia de energía cuando el europio y el APC se acercan a través de interacciones biomoleculares.
Cuando estos dos fluoróforos se unen mediante una interacción biomolecular, una parte de la energía capturada por el europio durante la excitación se libera a través de la emisión de fluorescencia a 620 nm, mientras que la energía restante se transfiere al APC. Esta energía es luego liberada por APC como fluorescencia específica a 665 nm solo a través de FRET con europio.
A través del diseño del ensayo de cribado de alto rendimiento , los materiales se mezclan y, si la enzima actúa sobre el péptido, todos los componentes se unirán a sus respectivos objetivos y se producirá FRET. [8]
El instrumento utilizado para medir el ensayo retrasa la lectura de la luz emitida en varios cientos de milisegundos después de la luz incidente / de excitación (el pulso de energía luminosa suministrado por el instrumento para excitar la molécula donante) para eliminar cualquier `` diafonía ''. entre las señales de excitación y emisión. ('intercomunicación' en este caso se refiere a la superposición de perfiles espectrales, lo que podría resultar en falsos positivos, falsos negativos o sensibilidad reducida según el diseño del ensayo. [9] ) Este proceso comprende el aspecto de 'resolución en el tiempo' del ensayo.
Referencias
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- ^ Piston, David W .; Kremers, Gert-Jan (2007). "FRET de proteína fluorescente: lo bueno, lo malo y lo feo". Tendencias en Ciencias Bioquímicas . 32 (9): 407–414. doi : 10.1016 / j.tibs.2007.08.003 . ISSN 0968-0004 . PMID 17764955 .
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