La eficiencia de transformación es la eficiencia mediante la cual las células pueden absorber ADN extracelular y expresar genes codificados por él. Esto se basa en la competencia de las células. Puede calcularse dividiendo el número de transformantes exitosos por la cantidad de ADN utilizada durante un procedimiento de transformación . Los transformantes son células que han absorbido ADN (extraño, artificial o modificado) y que pueden expresar genes en el ADN introducido.
Medición
La eficiencia de transformación debe determinarse en condiciones de exceso de células. [1] El número de células viables en una preparación para una reacción de transformación puede oscilar entre 2 × 10 8 y 10 11 ; Los métodos más comunes de preparación de E. coli producen alrededor de 10 10 células viables por reacción. Los plásmidos estándar usados para la determinación de la eficiencia de transformación en Escherichia coli son pBR322 u otros vectores de tamaño similar o más pequeños, como la serie de vectores pUC. Sin embargo, pueden usarse diferentes vectores para determinar su eficiencia de transformación. Pueden usarse 10-100 pg de ADN para la transformación, puede ser necesario más ADN para una transformación de baja eficiencia (generalmente el nivel de saturación se alcanza por encima de los 10 ng). [2]
Después de la transformación, el 1% y el 10% de las células se siembran en placas por separado, las células se pueden diluir en medio según sea necesario para facilitar la siembra en placas. Puede usarse una dilución adicional para una transformación de alta eficiencia.
La eficiencia de transformación se puede medir en transformantes o unidades formadoras de colonias (ufc) por µg de ADN usado. Una eficiencia de transformación de 1 × 10 8 ufc / g para un pequeño plásmido como pUC19 es aproximadamente equivalente a 1 en 2000 moléculas del plásmido utilizado de ser transformado. En E. coli , el límite teórico de la eficiencia de transformación para los plásmidos más comúnmente utilizados sería de más de 1 × 10 11 ufc / μg. En la práctica, el mejor resultado alcanzable puede ser de alrededor de 2-4 × 10 10 ufc / μg para un plásmido pequeño como pUC19, y considerablemente más bajo para plásmidos grandes.
Factores que afectan la eficiencia de la transformación
Las células individuales son capaces de absorber muchas moléculas de ADN, pero la presencia de múltiples plásmidos no afecta significativamente la ocurrencia de eventos de transformación exitosos. [3] Varios factores pueden afectar la eficiencia de la transformación: [1]
Tamaño del plásmido : un estudio realizado en E. coli encontró que la eficiencia de transformación disminuye linealmente con el aumento del tamaño del plásmido , es decir, los plásmidos más grandes se transforman menos bien que los plásmidos más pequeños. [3]
Formas de ADN : el plásmido superenrollado tiene una eficiencia de transformación ligeramente mejor que los plásmidos relajados; los plásmidos relajados se transforman con una eficiencia de alrededor del 75% que los superenrollados. [3] Sin embargo, el ADN lineal y monocatenario tiene una eficiencia de transformación mucho menor. ADN monocatenarios se transforman en 10 4 menor eficiencia que los de doble cadena.
Genotipo de células : las cepas de clonación pueden contener mutaciones que mejoran la eficiencia de transformación de las células. Por ejemplo, las cepas de E. coli K12 con la mutación deoR , que originalmente se encontró para conferir la capacidad de la célula para crecer en un medio mínimo usando inosina como única fuente de carbono, tienen 4-5 veces la eficiencia de transformación de cepas similares sin ella. Para el ADN lineal, que está pobremente transformado en E. coli , la mutación recBC o recD puede mejorar significativamente la eficiencia de su transformación.
Crecimiento de células : las células de E. coli son más susceptibles de volverse competentes cuando están creciendo rápidamente; por lo tanto, las células se recolectan normalmente en la fase logarítmica temprana del crecimiento celular cuando se preparan células competentes. La densidad óptica óptima para recolectar células normalmente se encuentra alrededor de 0.4, aunque puede variar con diferentes cepas celulares. También se ha encontrado que un valor más alto de 0,94-0,95 produce un buen rendimiento de células competentes, pero esto puede ser poco práctico cuando el crecimiento celular es rápido. [4]
Métodos de transformación : el método de preparación de las células competentes, la duración del choque térmico, la temperatura del choque térmico, el tiempo de incubación después del choque térmico, el medio de cultivo utilizado y varios aditivos, todos pueden afectar la eficiencia de transformación de las células. La presencia de contaminantes así como ligasa en una mezcla de ligadura puede reducir la eficiencia de transformación en la electroporación, [5] y la inactivación de ligasa o extracción de cloroformo del ADN puede ser necesaria para la electroporación; alternativamente, use solo una décima parte de la mezcla de ligadura para reducir la cantidad de contaminantes. La preparación normal de células competentes puede producir una eficiencia de transformación que varía de 10 6 a 10 8 ufc / μg de ADN. Sin embargo, existen protocolos para el método químico para hacer células supercompetentes que pueden producir una eficiencia de transformación de más de 1 x 10 9 . [6] El método de electroporación en general tiene una mejor eficiencia de transformación que los métodos químicos con más de 1 x 10 10 ufc / μg de ADN posible, y permite transformar plásmidos grandes de 200 kb de tamaño.
Daño al ADN : la exposición del ADN a la radiación UV en el procedimiento de electroforesis en gel de agarosa preparativa estándar durante tan solo 45 segundos puede dañar el ADN y esto puede reducir significativamente la eficiencia de transformación. [7] Sin embargo, agregar citidina o guanosina al tampón de electroforesis a una concentración de 1 mM puede proteger al ADN de daños. Se debe utilizar una radiación UV de mayor longitud de onda (365 nm) que cause menos daño al ADN si es necesario trabajar en el ADN en un transiluminador UV durante un período de tiempo prolongado. Este UV de longitud de onda más larga produce una fluorescencia más débil con el bromuro de etidio intercalado en el ADN, por lo tanto, si es necesario capturar imágenes de las bandas de ADN, se pueden usar radiaciones UV de longitud de onda más corta (302 o 312 nm). Sin embargo, dicha exposición debe limitarse a un período de tiempo muy corto si el ADN se va a recuperar más tarde para la ligadura y la transformación.
Ver también
Referencias
- ^ a b Hanahan, D .; Jessee, J .; Bloom, FR (1991). "Transformación de plásmidos de Escherichia coli y otras bacterias". Métodos en enzimología . 204 : 63-113. doi : 10.1016 / 0076-6879 (91) 04006-a . ISBN 9780121821050. PMID 1943786 .
- ^ "Cálculo de la eficiencia de transformación" . Sigma-Aldrich .
- ^ a b c Hanahan D (1983). "Estudios sobre la transformación de Escherichia coli con plásmidos". J. Mol. Biol . 166 (4): 557–580. doi : 10.1016 / S0022-2836 (83) 80284-8 . PMID 6345791 .
- ^ Tang, X .; Nakata, Y .; Li, HO; Zhang, M .; Gao, H .; Fujita, A .; Sakatsume, O .; Ohta, T .; Yokoyama, K. (1994). "La optimización de preparaciones de células competentes para la transformación de E. Coli" . Investigación de ácidos nucleicos . 22 (14): 2857–2858. doi : 10.1093 / nar / 22.14.2857 . PMC 308259 . PMID 8052542 .
- ^ Ymer, S. (1991). "La inactivación por calor de la ADN ligasa antes de la electroporación aumenta la eficiencia de transformación" . Investigación de ácidos nucleicos . 19 (24): 6960. doi : 10.1093 / nar / 19.24.6960 . PMC 329344 . PMID 1762931 .
- ^ Inoue, H .; Nojima, H .; Okayama, H. (1990). "Transformación de alta eficiencia de Escherichia coli con plásmidos". Gene . 96 (1): 23-28. doi : 10.1016 / 0378-1119 (90) 90336-P . PMID 2265755 .
- ^ Gründemann D, Schömig E. (1996). "Protección del ADN durante la electroforesis en gel de agarosa preparativa contra el daño inducido por la luz ultravioleta" (PDF) . BioTechniques . 21 (5): 898–903. doi : 10.2144 / 96215rr02 . PMID 8922632 .
enlaces externos
- Calculadora de eficiencia de transformación de bacterias